Methodenartikel

Gecombineerd

19.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51612

⸱

16 oktober 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Orthopaedic Hospital Research Center, Orthopaedic Hospital Department of Orthopaedic Surgery, David Geffen School of Medicine at University of California, Los Angeles (UCLA), 2PerkinElmer, 3Department of Dermatology, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Department of Orthopaedic Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Gecombineerde optische en μCT beeldvorming in een muismodel van orthopedische implantaten infectie, gebruik van een bioluminescent gemanipuleerde stam van Staphylococcus aureus, die het vermogen om de dynamiek van de bacteriële infectie, evenals de overeenkomstige ontstekingsreactie en anatomische veranderingen in de noninvasively longitudinaal bewaken bone.

Samenvatting

Multimodale beeldvorming heeft zich ontpopt als een gemeenschappelijke technologische aanpak in zowel preklinisch en klinisch onderzoek. Geavanceerde technieken die samen in vivo optische en μCT beeldvorming laat de visualisatie van biologische fenomenen in een anatomische context. Deze beeldvormende technieken kan vooral nuttig zijn om de voorwaarden te bestuderen die van invloed zijn bot. In het bijzonder orthopedisch implantaat infecties een belangrijk probleem bij klinische orthopedische chirurgie. Deze infecties zijn moeilijk te behandelen omdat bacteriële biofilms te vormen op de vreemde chirurgisch geïmplanteerde materiaal, wat leidt tot aanhoudende ontsteking, osteomyelitis en eventuele osteolyse van het bot rondom het implantaat, wat uiteindelijk resulteert in implantaten losraken en falen. Hier, een muismodel van een geïnfecteerde orthopedische prothetische implantaat gebruikt dat de betrokken chirurgische plaatsing van een Kirschner-draad te implanteren in een intramedullaire kanaal van het dijbeen zodanig dat het uiteinde van het implantaat eXtended in het kniegewricht. In dit model, LysEGFP muizen, een muizenstam die EGFP-fluorescent neutrofielen heeft, werkzaam in combinatie met een bioluminescente Staphylococcus aureus stam, die natuurlijk licht uitzendt. De bacteriën werden geïnoculeerd in de kniegewrichten van de muizen voor het afsluiten van de operatieplaats. Bioluminescentie en fluorescentie beeldvorming werd gebruikt voor kwantificering van de bacteriële last en neutrofielen ontstekingsreactie, respectievelijk. Bovendien werd μCT beeldvorming uitgevoerd op dezelfde muizen, zodat de 3D-locatie van de bioluminescente en fluorescerende optische signalen kunnen worden geregistreerd samen met de anatomische μCT afbeeldingen. Om de veranderingen in het bot in de tijd gekwantificeerd, buitenste botvolume van het distale dijbeen werden gemeten op bepaalde tijdstippen met behulp van een semi-automatische contour gebaseerd segmentatieproces. Samengevat, de combinatie van bioluminescentie / fluorescente beeldvorming μCT beeldvorming kan bijzonder nuttig fof invasieve bewaking van de infectie ontstekingsreactie en anatomische veranderingen in het bot in de tijd.

Inleiding

Multimodaliteit preklinische beeldvormende technieken die de combinatie van optische en anatomische informatie te betrekken, zodat de visualisatie en controle van biologische fenomenen in 3D 1-4. Sinds μCT beeldvorming maakt de prachtige visualisatie van bot anatomie, met μCT beeldvorming in combinatie van met optische beeldvorming is een unieke combinatie die vooral nuttig zijn voor het onderzoek naar processen die botbiologie 5-7 betrekken zou kunnen zijn. Een voorbeeld zou zijn om deze technieken te gebruiken om orthopedische implantaten infecties, die een desastreuze complicatie na orthopedische ingrepen 8,9 vertegenwoordigen bestuderen. Bacteriën biofilms gevormd op de geïmplanteerde vreemde voorwerpen die de overleving van de bacteriën bevorderen door als een fysieke barrière die immuuncellen voorkomt aftasten van de infectie en blokken antibiotica toegang de bacteriën 10,11. De chronische en persisterende infectie van het gewricht weefsel (septische artritis) eend bot (osteomyelitis) induceert botresorptie die leidt tot het loskomen van de prothese en uiteindelijk falen 8,9. Het resulterende periprosthetic osteolyse wordt geassocieerd met verhoogde morbiditeit en mortaliteit 12,13.

In ons eerdere werk werd bioluminescentie en fluorescentie beeldvorming met röntgenstraling en micro computed tomography imaging (μCT) gebruikt in een orthopedische gewrichtsprothese infectiemodel in muizen 14-19. Dit model betrokken plaatsen van een titanium Kirschner-draad (K-wire) zodanig dat het afgesneden uiteinde van het implantaat uitgebreid in het kniegewricht van de dijbenen van muizen 14-19. Een inoculum van Staphylococcus aureus (stam bioluminescent Xen29 of Xen36) werd gepipetteerd op het oppervlak van het implantaat in het kniegewricht voor het chirurgisch gesloten 14-19. In vivo optische beeldvorming werd gebruikt voor het detecteren en kwantificeren bioluminescent signalen, die overeen met de nuember bacteriën in de geïnfecteerde gewrichten en botweefsel 14-19. Bovendien, in vivo fluorescentie beeldvorming van LysEGFP muizen die fluorescent neutrofielen 20 bezitten, werd gebruikt om het aantal neutrofielen die emigreerde naar de besmette kniegewrichten waarin de K-draad implantaten 14,19 kwantificeren. Tenslotte anatomische beeldvormingsmodaliteiten, waaronder high-resolution X-ray imaging en μCT imaging, toegelaten respectievelijke 2D en 3D anatomische beeldvorming van het getroffen been over de gehele duur van chronische infectie, die we willekeurig zou typisch eindigen tussen 2 en 6 weken postoperatief 16 , 18. Met dit model kan de effectiviteit van lokale en systemische antimicrobiële therapie, beschermende immuunrespons en pathologische anatomische veranderingen in bot worden geëvalueerd 14-18. In dit manuscript, werden de gedetailleerde protocollen voor de optische en μCT beeldvormende modaliteiten in dit orthopedische prothesen gezamenlijke infectie model geleverd als een Franstalve systeem biologische processen bij de anatomische context van het bot. Deze omvatten de chirurgische procedures voor het modelleren van een orthopedische prothesen gezamenlijke infectie in muizen, 2D en 3D in vivo optische beeldvorming procedures (bacteriële bioluminescentie signalen en fluorescerende neutrofielen signalen te detecteren), μCT beeldvorming acquisitie en-analyse en co-registratie van 3D optische beelden met de μCT afbeeldingen.

Protocol

Ethiek statement: Alle dieren werden in strikte overeenstemming met de goede praktijken dier, zoals gedefinieerd in de federale regelgeving, zoals uiteengezet in de Animal Welfare Act (AWA) behandeld, de Gids 1996 voor de verzorging en gebruik van proefdieren en de PHS beleid voor de Humane zorg en gebruik van proefdieren en alle dierlijke werk werd goedgekeurd door de Johns Hopkins Animal Care en gebruik Comite (Protocol: MO12M465).

1 Voorbereiden van de Entmateriaal van Mid-logaritmische Bioluminescente Bacteriën

  1. Streak bioluminescente S. aureus stam Xen29 (of een andere bioluminscent stam zoals Xen36) op tryptische soja-agar platen (tryptische soja bouillon agar [1,5%]).
    OPMERKING: S. aureus Xen29 21 is een genetisch gemanipuleerde S. aureus stam die een gemodificeerde lux operon afgeleid van Photorhabdus luminescens, die is geïntegreerd in een natieve plasmide stabiel in deze bacteriële stam bevat. Deze motorEred bacteriën constitutief licht uitzenden van live-en metabolisch actieve cellen.
  2. Groeien de kolonies op de platen te incuberen bij 37 ° C gedurende ongeveer 16 uur (O / N).
  3. Selecteer enkele bacteriële CFU en cultuur in schudden vloeistof TSB (240 rpm) gedurende ongeveer 16 uur (O / N).
  4. Voer een subcultuur met 1/50 verdunning van het O / N cultuur tot mid-logaritmische groeifase van bacteriën (ongeveer 2 uur duur) te verkrijgen.
  5. Pellet, resuspendeer en wassen de bacteriën 3x in PBS.
  6. Schat de bacteriële inocula (1 x 10 3 CFU in 2 pl PBS) door bepaling van de optische dichtheid absorptie bij 600 nm.
  7. Controleer de CFU in de entstof na het kweken van de bacteriën O / N op de borden.

2 Mouse Chirurgische ingrepen

LET OP: Voor deze experiment, gebruik dan een twaalf weken oude mannelijke LysEGFP muizen. Deze muizen bezitten versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP) expressie myeloïde cellen (die bestaan ​​uit mostly neutrofielen) 20. Aanvullen steriele omstandigheden tijdens de operatie en na chirurgische prep met betadine en 70% alcohol plaatsen elke muis in een steriel laken op een hard oppervlak watercirculatie verwarmingsplaat. Gebruik toga, steriele handschoenen, masker en steriliseren instrumenten.

  1. Verdoven van de muis met behulp van een 2% inademing van isofluraan. Gebruik dierenarts zalf op de ogen tot droog te voorkomen terwijl ze onder narcose. Het passende niveau van de anesthesie door het observeren van de ademhaling, spierspanning, teen knijpen, cornea reflex en de kleur van de slijmvliezen. Bedek de muizen met een steriele chirurgische doek met een gat aan de operatie aan de rechter knie. De muis moet ondersteunende verwarming maatregelen om het lichaam op temperatuur te houden terwijl ze onder narcose te krijgen. Warm 37 ° C water circuleert in een warme watermantel deken of een water circuleert hard plastic verwarmd werkstation (ProStation, Patterson, Scientific) zijn goede manieren om onderkoeling te voorkomen.
  2. Injecteren buprenorphine (vertraagde afgifte) (2,5 mg / kg) subcutaan juist voorafgaande aan chirurgie. Bijkomende doses van aanhoudende afgifte buprenorfine kan op 3 daagse intervallen worden toegediend als nodig is voor analgesie.
  3. Scheer de operatieve knie en prep met drie afwisselende scrubs met betadine en 70% alcohol.
  4. Voer een middellijn incisie in de bovenliggende huid rechts kniegewricht. Verleng de huid incisie waardoor de extensor mechanisme goed te definiëren.
  5. Voer een mediale parapatellaire arthrotomie en sublux de quadriceps-patellapees extensor mechanisme zijdelings met een Adson pincet.
    OPMERKING: Dit brengt de intercondylaris inkeping van het dijbeen in het zicht.
  6. Handmatig ruimen de intramedullaire kanaal met behulp van een 25 G naald, gevolgd door een 23 G naald.
    Opmerking: Om schade te voorkomen aan het dijbeen, kan een stabiliserend platform worden gebruikt. Dit zou belangrijk de techniek een toevallig fractuur van de femur te minimaliseren.
  7. Plaats een medische kwaliteit titanium Kirschner-draad (0,8 mm diameter) met behulp van een pers-fit techniek, die handmatig met zich meebrengt te duwen met behulp van een pin houder, in een retrograde richting in het intramedullaire kanaal.
    OPMERKING: Titanium K-draden werden gebruikt als er minder artefacten zien op de μCT beelden met titanium K-draden vergelijking met roestvrij staal K-draden 16.
  8. Snij het einde van de Kirschner-draad met pin cutters zodat het afgesneden uiteinde van de K-draad loopt ongeveer 1 mm in het kniegewricht ruimte.
  9. Met behulp van een micropipet, pipet 2 ui 1 x 10 3 CFU bioluminescent S. aureus Xen29 op de punt van het implantaat in het kniegewricht ruimte.
    OPMERKING: Meer volume betekent uitbreiding verontreiniging weefsel en minder discrete imaging.
    OPMERKING: In control-geïnfecteerde muizen, voeg 2 pl steriele zoutoplossing zonder bacteriën.
  10. Verminder de quadriceps-patella complex terug naar middellijn behulp van een tang en sluit de bovenliggende onderhuidse weefsel en de huid met behulp van absorbeerbaresubcutane hechtingen.
    OPMERKING: Gebruik geen dier onbeheerd verlaten totdat het voldoende weer bij bewustzijn is om borstligging behouden. Heeft een dier die een operatie heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot ze volledig hersteld niet meer terug.
  11. Aan het eind van de experimenten, alle dieren gedood middels inhalatie van kooldioxide volgens de Johns Hopkins Animal Care en gebruik Committee richtlijnen. Controleer dood door het observeren van de dieren niet herstellen binnen 10 minuten na blootstelling kooldioxide eindigt en cervicale dislocatie.

3 2D Optical Imaging (bioluminescentie en Fluorescent Imaging)

  1. Verdoven LysEGFP muizen (bijvoorbeeld 2% inhalatie isofluraan) en leg ze met de buikzijde naar boven in een beeldvorming kamer.
  2. Voeren bioluminescentie beeldvorming met behulp van de IVIS Spectrum optische hele dier in vivo imaging systeem. Controleer eerst Lichtende en bevestig de keuze van een open filter selectie, gezichtsveld (FOV) C - 13 cm, en scroll naar beneden om de blootstelling tijd Auto (automatische belichting instelling). Automatische belichting wordt automatisch aangepast acquisitie tijd (sluitertijd), binning (digitale pixel binning), en f-stop (diafragma) van het instrument om het signaal intensiteit te optimaliseren terwijl het vermijden van verzadiging. Klik vervolgens op Acquire aan de bioluminescentie beeld vast te leggen.
    OPMERKING: Voor bioluminescentie beeldvorming, image muizen tussen 1-5 minuten.
  3. Voeren sequentiële in vivo fluorescerende beeldvorming door het vakje naast de TL. Kies de 465 nm excitatie-filter en 520 nm emissie-filter. Scroll belichtingstijd omlaag om Auto en selecteer FOV C (stap 3.2.1). Klik vervolgens op Acquire op de foto om de fluorescentie te vangen.
    OPMERKING: Voor in vivo fluorescerende beeldvorming, image muizen tussen 0,5 sec.
  4. Kwantificeer de bioluminescentie signalen totale flux (fotonen / seconde) in een gebied van belang (ROI) met Living Image software van de eerste uitbreidingROI Tools van de Tool Palette.
    1. Selecteer de cirkel icoon en het aantal ROI die overeenkomen met het aantal dieren in het onderwerp FOV. Het formaat van de ROI voor de regio van belang te weten te omvatten, de bioluminescent diffusie patroon verzameld.
    2. Selecteer Meten ROI in ROI Extra in de Tool Palette en de ROI Venster Meting zal verschijnen. Totaal Radiance (fotonen / sec) waarden vertegenwoordigen de som van bioluminescentie pixels binnen de gegenereerde ROI.
    3. Kies de optie Alles en COPY tabbladen in de rechter benedenhoek van het venster worden de gegevens plakken in latere programma's over te brengen naar het klembord en laat voor analyse.
  5. Kwantificeren van de in vivo fluorescerende signalen als totale stralende efficiëntie ([fotonen / s] / [uW / cm 2]) binnen een cirkelvormig gebied van belang (ROI) met behulp van het Leven Beeld software.
    1. Binnen het levende beeld softwarevenster, uitbreiden ROI Extra in de Tool Palette. SelecteerCircle icoon en het aantal ROI dat overeenkomt met het aantal dieren in het onderwerp FOV.
    2. Formaat van de ROI het interessegebied nauw overeenkomt met de lichtgevende signaal van het vorige beeld acquisitie omvatten.
    3. Selecteer Meten ROI in ROI Extra in de Tool Palette en de ROI Venster Meting zal verschijnen.
      OPMERKING: Totaal Radiant Efficiency ([fotonen / s] / [uW / cm 2]) geeft de bedragen van fluorescerende pixels binnen de ROI.
    4. Alles selecteren en kopiëren tabs in de rechter benedenhoek van het venster worden de gegevens plakken in latere programma's over te brengen naar het klembord en laat voor analyse.

4 μCT Image Acquisition

  1. Plaats de verdoofde LysEGFP muizen in een beeldvorming kamer.
    Opmerking: Deze beeldvorming kamer is ontworpen om zowel de IVIS Spectrum beeldvormingssysteem en Quantum FX in vivo μCT imaging systeem waarmeeco-registratie van de optische en μCT afbeeldingen.
  2. Open de CT-software en selecteer het menu vooraf ingestelde 60 mm FOV std dynamisch uit de dropdown.
  3. Steek de grote boring deksel en de adapter arm voor de beeldvorming shuttle in het instrument.
  4. Plaats de muis imaging shuttle in de adapter arm duw de arm in de boring en sluit de deur. Schakel Live-modus (de knop Oog op het Control Panel) en de positie van het onderwerp in de 0 ° en 90 ° gantry positie met behulp van de X-as en Y-as controles om het dier in het venster X capture centreren. Schakel vervolgens de Live-modus door te klikken op de knop Eye.
  5. Het verwerven van een dynamisch beeld met de 60 mm FOV scan door te klikken op de knop CT Scan (naast de live-modus-knop). Exporteer de verworven afbeelding in de DICOM-formaat en op te slaan op een locatie die later kan worden geraadpleegd.
    OPMERKING: De geschatte dosis zal 26 mGy per scan. Een 30 mm FOV kunnen worden als hogere resolutie gewenst.

5.3D Optical Image Acquisition, Vorming en μCT Co-registratie

  1. Plaats de muis imaging shuttle inzetstuk in het Spectrum door het positioneren van de imaging-shuttle met de muis in deze inzet en zorgen voor de muis beweegt niet.
  2. Met behulp van het Leven Beeld, selecteer Imaging Wizard in de Acquisition Control Panel om de installatiewizard te starten. Om te beginnen, kiest bioluminescentie, dan DLIT, en selecteer vervolgens de verslaggever "Bacteriën" uit het dropdown-menu en de juiste emissie-filters voor het model wordt automatisch gekozen, in dit geval, 500-620 nm.
    1. Selecteer Volgende, dan wijzen de acquisitie parameters en vakinformatie in het laatste venster. Concreet zal Imaging Onderwerp zijn muis, zal Auto De instellingen worden geselecteerd waarmee automatische belichting om de signaalkwaliteit te maximaliseren, terwijl het vermijden van verzadiging, en het gezichtsveld wordt ingesteld op C - 13cm.
    2. Selecteer Voltooien in het laatste venster en de volgorde raam van de Overname Panel zal eenutomatically bevolkt met de DLIT volgorde. Er zal een image verworven per emissie-filter gekozen en automatische belichting zal de optimale instellingen kiest bij elke golflengte volgens de Imaging Wizard selecties zijn. De gegenereerde reeks bevat ook een gestructureerde afbeelding licht nodig is voor onder het oppervlak generatie via de Surface Topografie hulpmiddel hieronder beschreven.
  3. Kies Acquire Sequence aan de DLIT gegevens te verwerven.
  4. Nadat het beeld acquisitie is voltooid, het genereren van de oppervlakte topografie. Begin met het uitbreiden van het tabblad Surface Topografie onder de Tool Palette.
    1. Vervolgens selecteert u de richting dat getrouw de zijkant van het dier voor de camera of de bovenkant van de IVIS instrument. Klik vervolgens op Generate Surface. Uitsnede gebied van het beeldveld dat het dier bevat.
    2. Maak dan gebruik van de paarse masker om de grenzen van het dier te bepalen.
      OPMERKING: De masking tool maakt gebruik van kleurcontrast zodat dieren met een donkere vacht of huid niet adequaat zal maskeren van de stage.
    3. Selecteer Voltooien en de oppervlakte verschijnt automatisch. Sla het resultaat onder het tabblad Surface Topografie sluit vervolgens het tabblad als we niet meer nodig hebben.
  5. Reconstrueren de 3D ​​optische bron positie met behulp van de diffuse optische reconstructie algoritmen in het Leven Beeld 22 door het uitbreiden van het tabblad DLIT 3D Reconstructie geïmplementeerd.
    1. Beelden die voor de DLIT sequence worden getoond.
      OPMERKING: De software controleert automatisch de kwaliteit van de verkregen gegevens en zal ongedaan beelden geacht te zwak is of waar de verzadiging aanwezig is. Selecteer Start aan de onderkant rechts.
    2. Indien nodig kan men de drempel voor elk van bioluminescentie afbeelding door dubbel te klikken aanpassen en gebruiken van de drempelwaarden slider aan de onderkant linkerkant.
      LET OP: dit is vooral om lagere intensiteit signaal en voorzichtigheid te betrekken, dienen te worden beoefend wanneer drempelen hoger als deze algemene intensiteit van de uiteindelijke gereconstrueerde bron kan aanpassen.
    3. Als tevreden met de drempel, selecteert reconstrueren de reconstructie algoritmen die zal resulteren in een 3D weergave van de optische bron automatisch.
  6. Open de DICOM-browser door te klikken op het 3D-pictogram in de werkbalk aan de bovenkant van de software (derde van links) en zoek naar de Quantum FX afbeelding eerder verworven.
    1. Laad dit beeld in de Living Beeld tabblad 3D bekijken door te dubbelklikken op het bestand te importeren.
      OPMERKING: De referentiepunten moeten automatisch worden gedetecteerd en resulteren in beeld μCT wordt geregistreerd bij het 3D-beeld optische.
  7. Schakel het oppervlak topografie visualisatie kaart door het uitbreiden van 3D optische hulpmiddelen in de Tool Palette en deselecteren van het selectievakje met de naam Toon onderwerp Surface in het tabblad Surface.
  8. Handmatig een opzoektabel voor het skelet en de K-draad implantaat die zichtbaar zijn in het μCT beeld met behulp van het histogram op het tabblad Volume van de 3D Multi-Modali visualiserenty gedeelte Tools van de Tool Palette.
    1. Het histogram geeft de verdeling van de voxel-intensiteiten in de 3D volumetrische data en hun kleur ondoorzichtigheid. Om te bepalen wanneer de bijzondere weefsel van belang is in het histogram, de schuifregelaar gebruiken tool om de drempel rendering totdat het weefsel of structuur zichtbaar is.
    2. Klik dan rechts in het histogram om punten te genereren en vormen een bocht naar dat deel van het histogram te isoleren. Dit wordt herhaald voor elke structuur - skelet gevolgd door K-draad implantaat en kan worden opgeslagen als een opzoektabel voor toekomstige analyses.
    3. Componenten kunnen worden kleurcode desgewenst door te dubbelklikken op elke gegenereerde punt in het histogram en de gewenste kleur in het pop-up venster te selecteren.

6 μCT Afbeelding Visualisatie en analyse

  1. Het gebruik van de Quantum FX software, selecteert u de afbeelding van de rente en lanceren Viewer. Selecteer het gereedschap Roteren en heroriënteren de afbeelding om visualiZe de lengteas van het femur. Selecteer het meetinstrument en meet de femur lengte.
  2. Start de 3D-viewer om 3D-renderings te genereren. Pas de drempel om de veranderingen in het bot anatomie geassocieerd met implantaat infectie vertonen.
  3. Toepassen clipping vlakken zodat de 3D rendering beperkt tot de gewenste dwarsdoorsnede sectie van het gebied van belang in het distale femur.
  4. Start de Analyze 11.0 softwarepakket. Laad het * .VOX bestand dat werd gebruikt om de 3D-weergave te creëren.
  5. Start de afbeelding Calculator tool. Gebruik de 'Regio Pad' tool om de afbeelding bij te snijden (verwijder vliegtuigen die niet onder het dijbeen).
  6. Start de Oblique Secties tool. Gebruik de optie 3 punten punten te vinden in het midden van het dijbeen, trochanter major en het einde van de pen. Maak deze punten een schuin vlak en het genereren van een beeld met nieuwe segmenten.
  7. Lanceer het gebied van belang tool. Geef het transaxiale plakjes. Pas de min en max instellings het corticale bot geven. Maak contouren voor de overeenkomstige segmenten van een aantal segmenten (met een interval van ongeveer 5 segmenten) voor de segmenten die overeenkomt met de distale 25% van het femur. Gebruik het gereedschap 'Propagate Regio' interpoleren tussen deze contouren en het creëren van een 3D-regio van belang. Bewaar deze regio van belang als een object kaart.
  8. Start de 'Sample Options' tool. Schakel het selectievakje in voor het object kaart die net is gemaakt en selecteer de radio knoppen voor de juiste opties. Klik op het 'Configure Log Stats' knop om te bevestigen dat het selectievakje 'Volume' is geselecteerd. Klik op de knop 'Sample Images' om de werkelijke metingen.
  9. Het volume metingen exporteren naar een data-analyse programma. Normaliseren van de buitenste been volumes van latere tijdstippen om de eerste afgebeeld tijdstip met de formule: Δ Volume (%) = ([Volume (dag X) - Volume (dag 2)] / [volume (dag 2)]) x 100 .
    OPMERKING: In deze formule, de variabele "X" staat voor het tijdstip van belang. Het verkregen getal wordt de verandering in de omvang van de buitenste botvolume van de distale femur tijd vertegenwoordigen.
  10. Om het 3D-gebied van de rente op de top van het bot te visualiseren, laadt het CT-beeld in de 'Volume Render' tool. Laad het object map van de 3D-regio van belang. Ga naar 'View''Objects' en zet de 'Original' zijn 'On'. Open het venster 'Preview'. Start het menu 'Render Types' en selecteer 'Object compositing'.
  11. Klik op de 'Threshold' knop en het gereedschap en de drempels aan te passen tot op het bot en object kaart tonen. Gebruik dezelfde vaste drempel bereik voor alle tijdstippen. Klik op de knop 'Rotation' en zet de oriëntatie op een ware anterolaterale zicht zijn. Klik op 'Render' om de uiteindelijke rendering genereren. Sla de weergave van de belangrijkste 'VolumeRender 'venster.

Resultaten

In vivo bioluminescentie en fluorescerende beeldvorming

In deze studie wordt het protocol beschreven voor de eerder gepubliceerde model van een orthopedische gewrichtsprothese infectie bij muizen 14-19, waarbij de chirurgische plaatsing van een titanium K-wire implantaat die zich uitstrekt van een intramedullaire kanaal van het dijbeen in de voeg impliceert ruimte 14-19. S. aureus stam bioluminescent Xen29 (1 x 10 3 CFU in 2 pi PBS) werd direct gepipetteerd bovenop het einde titanium implantaat in het kniegewricht voor het afsluiten van de operatieplaats 16. Te visualiseren en kwantificeren van de bacteriële last en de influx van neutrofielen noninvasively in verdoofde LysEGFP muizen, werd in vivo hele dier optische beeldvorming uitgevoerd afbeelding om achtereenvolgens de bioluminescentie signalen van de bacteriën en de EGFP fluorescerende signalen van het infiltreren van neutrofielen met behulp van de IVIS Spectrum optische hele dier in vivobeeldvormingssysteem drie postoperatieve dagen (bijvoorbeeld, 2 dagen, 14 en 28). Het bioluminescente signalen Xen29-geïnfecteerde muizen hierboven achtergrondsignalen van sham-geïnfecteerde muizen gedurende de duur van het experiment (Figuur 1 A, C) 16 bleef. Onze vorige werk aangetoond dat de in vivo bioluminescentie signalen dicht benaderd de nummers van ex vivo CFU geïsoleerd van de gezamenlijke / botweefsel en aanhanger van de implantaten 17,18. Bovendien, het EGFP fluorescentiesignalen waren hoger dan sham-geïnfecteerde muizen op vroege tijdspunten maar benaderd achtergrondniveaus tijdens infectie (Figuur 2B, C) ​​16.

3D co-registratie van in vivo optische signalen met μCT beelden

De optische signalen (bijvoorbeeld bacteriële bioluminescente en EGFP fluorescentiesignalen) in de anatomische context van de postoperatieve kniegewrichten visualiseren in 3D, de optische beelden gegenereerd met behulp van de IVIS Spectrum imaging systeem waren co-geregistreerd bij μCT beelden gegenereerd met behulp van de Quantum FX μCT imaging systeem. Dit co-registratie kan worden verwezenlijkt vanwege de muis beeldvorming kamer kan worden ingebracht in hetzij de machine zodat de muizen waren exact dezelfde richting. Om deze nauwkeurigheid te verifiëren, werden de resultaten vergeleken met een beeld acquisitie met behulp van de IVIS Spectrum CT in vivo imaging systeem dat beide modaliteiten in een apparaat geïntegreerd zonder dat fysieke verplaatsing van het dier. Om de optische data op de μCT beelden in 3D-kaart, hebben we gebruik gemaakt van een diffuse optische tomografie reconstructiealgoritme 16. De resulterende 3D ​​reconstructie wordt getoond (Film 1).

Daarnaast μCT beeldvorming toegestaan ​​de visualisatie en kwantificatie van de daaruit voortvloeiende wijzigingen in de kwaliteit en de afmetingen van het bot dat zich tijdensde infectie (figuur 2) 16. Zoals eerder gemeld, de buitenste botvolume van de distale femur aanzienlijk toegenomen in de tijd (Figuur 2A) 16. Om deze veranderingen te kwantificeren, werd 3D volumetrische beeldanalyse uitgevoerd op het distale 25% van het benige oppervlak van de femur en de veranderingen in het botvolume tijd werden genormaliseerd tot de aanvankelijke botvolume. De buitenste botvolume aanzienlijk toegenomen in geïnfecteerde muizen vergeleken met sham-geïnfecteerde muizen (Figuur 2B) 16. De toename van het distale femur buitenste botvolume waarschijnlijk als gevolg van schade bot veroorzaakt door de infectie van de gezamenlijke weefsel en bot, die werden waargenomen met μCT beeldvorming en histologische analyse 16.

figure-results-1
Figuur 1 2D in vivo bioluminescente en fluorescerende signalen. S. aureus Xen29 of geen bacteriën (niet-geïnfecteerde) werden geënt in het kniegewricht na de K-draad plaatsing en LysEGFP muizen werden afgebeeld met behulp van de IVIS Spectrum imaging-systeem 16. (A) Mean in vivo bioluminescentie signalen, zoals gemeten door de totale flux (fotonen / sec) ± sem. (B) gemiddelde in vivo EGFP fluorescerende signalen, zoals gemeten door de totale stralende efficiëntie (fotonen / sec) / (uW / cm 2) ± sem. (C) Vertegenwoordiger in vivo bioluminescentie en fluorescerende signalen overlay op een zwart-witte fotografische beeld van de muizen. De detectiegrens van de bacteriële last met behulp van bioluminescentie beeldvorming ligt tussen de 1 x 10 2 en 1 x 10 3 CFU. * P <0,05, † p <0,01, ‡ p <0,001 Xen29-geïnfecteerde muizen versus sham-geïnfecteerde muizen (t-test van Student [two-tailed]). Gelieveop: dit is een representatieve waarde die eerder gepubliceerde gegevens die zijn gegenereerd met behulp van Xen29 en afgebeeld met de IVIS Lumina XR imaging systeem 16 omvat. klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2 3D μCT beeldvorming. S. aureus Xen29 of geen bacteriën (niet-geïnfecteerde) werden geënt in het kniegewricht na de K-draad plaatsing en muizen werden afgebeeld met behulp van de Quantum FX in vivo μCT systeem. (A) Vertegenwoordiger 3D μCT renderings van Xen29 geïnfecteerde muizen (bovenste panelen) en sham-geïnfecteerde muizen (onderste panelen). (B) Percentage buitenste been volumeverandering (distale 25% van het dijbeen) genormaliseerd naar de oorspronkelijke time Point (gemiddelde ± SEM). * P <0,05, † p <0,01, ‡ p <0,001 Xen29-geïnfecteerde muizen versus sham-geïnfecteerde muizen (t-test van Student [two-tailed]). Let op: dit is een representatieve waarde die eerder gepubliceerde gegevens die zijn gegenereerd met behulp van de bioluminescentie stam S. omvat aureus Xen29 en afgebeeld met de Quantum FX in vivo μCT imaging systeem 16. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Film 1 . Representatieve 3D anatomisch co-registratie van de Xen29 bioluminescente signalen en de EGFP-neutrofiel fluorescentiesignalen in combinatie met de μCT afbeeldingen. De beelden worden geroteerd op de verticale as.

Discussie

Multimodale beeldvorming zoals beeldvormende technieken die gebruik maken van in vivo optische beeldvorming in combinatie met μCT beeldvorming zorgt voor een nieuwe technologische benadering die de 3D-visualisatie, kwantificering en longitudinale monitoring van biologische processen in een anatomische context 1-4 maakt. De protocollen in de onderhavige studie gedetailleerde informatie over hoe bioluminescentie en fluorescentie beeldvorming te combineren met μCT beeldvorming in een orthopedische prothetische implantaat infectiemodel in muizen invasief en longitudinaal op toezien de bacteriële belasting, neutrofiele ontsteking en anatomische veranderingen in het bot tijd. Samengevat, verkregen door het combineren van optische en structurele beeldvorming informatie een belangrijke technologische vooruitgang, eventueel bijzonder geschikt om biologische processen en pathologische aandoeningen waarbij het bewegingsapparaat invloed te bestuderen.

Een belanging vaststelling dat moet worden opgemerkt is dat waargenomen dat de EGFP-neutrofielen fluorescentiesignalen verlaagd tot achtergrondniveaus van 14-21 dagen en bleef op achtergrondniveaus gedurende de duur van het experiment ondanks de aanwezigheid van bioluminescente bacteriën. Het is onwaarschijnlijk dat de X-ray bestraling beïnvloed neutrofiel overleving we vergelijkbare kinetiek van neutrofielen signalen waargenomen in niet-bestraalde muizen 19. In ons vorige werk met een model van S. aureus geïnfecteerde wonden, neutrofiele infiltratie bevatten een combinatie van krachtige neutrofiel rekrutering vanuit de circulatie verlengd neutrofiele overleving op de plaats van infectie en de homing van KIT + voorlopercellen naar het abces, waar zij lokaal leiden tot neutrofielen 23 rijpen. Het is waarschijnlijk dat soortgelijke processen bijgedragen aan neutrofielen infiltratie in de orthopedische implantaten S. aureus infectie model. Hoewel het niet bekend waarom de neutrofielen signalen daalde in het Orthopaedic infectie model, kan het zijn dat de immuunrespons veranderd in de tijd als deze infectie gevorderd van een acute naar chronische infectie en dit is een onderwerp van toekomstig onderzoek.

Er zijn beperkingen met dit muismodel orthopedische gewrichtsprothese infectie en in vivo multimodale beeldvorming die opgemerkt. Ten eerste, dit muismodel is een oversimplificatie van de werkelijke procedures en materialen die worden gebruikt in de orthopedische chirurgie bij de mens 24. Toch, dit model doet recapituleren de chronische infectie en daaropvolgende ontsteking in het bot-en gewrichtsziekten weefsel dat wordt gezien in de menselijke orthopedische implantaten infecties 8,9. Ook de μCT beelden verkrijgen, werden relatief lage doses röntgenstraling gebruikt om nadelige effecten op de gezondheid van de dieren gedurende het verloop van de infectie te beperken. Voor betere resolutie been hogere dosis röntgenstraling kan worden gebruikt voor beeldvorming op μCT geëuthanaseerd eennimals. Dit zou echter de mogelijkheid elimineren om het bot veranderingen tijdens de duur van de experimenten noninvasively longitudinaal volgen.

De conclusie is dat multimodale beeldvorming met betrekking tot de combinatie van in vivo hele dier optische beeldvorming met anatomische μCT beeldvorming meer uitgebreide informatie over de infectie en inflammatoire respons toegestaan. Bovendien hebben deze technieken de evaluatie van de gevolgen van de infectie en ontsteking van het bot en gewrichtsweefsel toegestaan. Toekomstige werkzaamheden kunnen profiteren van multimodale beeldvorming om de werkzaamheid van antimicrobiële therapieën, immuunreacties pathogenese van de ziekte en de reactieve veranderingen in het bot evalueren we begonnen te onderzoeken 14-18. Daarnaast kunnen multimodale beeldvorming probes en tracers evalueren om de aanwezigheid van een infectie diagnose zoals eerder beschreven in diermodellen een dij infectie, endocarditis, pulmonaire Infectionen en biomateriaal infecties 25-28. Tot slot kan het gebruik van de multimodale beeldvorming voorbij besmettelijke ziekten worden uitgebreid en toegepast in alle disciplines, waaronder orthopedie, reumatologie en oncologie, aan andere voorwaarden te onderzoeken die de impact van het bewegingsapparaat, zoals het skelet kanker, metastasen, fracturen en artritis 5-7 .

Openbaarmakingen

JAM, BNT, EL, NZ, KPF zijn betaalde werknemers van PerkinElmer, die de beeldvorming instrumenten produceert, verstrekt de Xen29 bioluminescente S. aureus stam, en betaald voor de kosten van deze video-artikel publicatie. De overige auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door een H & H Lee Surgical Resident Research Scholars Program (JAN), een AO Foundation startsubsidie ​​S-12-03M (LSM) en de National Institutes of Health subsidie ​​R01-AI078910 (LSM) .

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Xen36 bioluminescent Staphylococcus aureus strainPerkinElmerBioluminescent Staphylococcus aureus-stam afgeleid van ATCC 49525 (Wright), een klinisch isolaat van een bacteriëmiepatiënt
Tryptic soy brothBD Biosciences, Franklin Lakes, NJ211825
Bacto Soy AgarBD Biosciences, Franklin Lakes, NJ214010
LysEGFP knockin muisstamNiet commercieel verkrijgbaar. Deze stam bevat een knockin van enhanced green fluorescence protein (EGFP) in het lysozyme M-gen
BetadinePurdue Products, Stamford, CT
Kirschner-draad (titanium, 0,8 mm diameter)Synthes, West Chester, PA492.08
Draadsnijder - Duracut T.C.H&H Company, Ontario, Canada83-7002
IsofluraanBaxter, Deerfield, IL118718
Vicryl 5-0 hechtdraad (P-3 omgekeerd snijdend)Ethicon, Summerville, NJ. Aangeschaft via VWR International.95056-936
Sustained-release Buprenorfine (5 ml - 1 mg/ml)Zoopharm, Windsor, COpijnstiller
IVIS Spectrum Imaging SystemPerkinElmer, Hopkinton, MAoptisch in vivo beeldvormingssysteem
Quantum FX in vivo µCT systeemPerkinElmer, Hopkinton, MAµCT in vivo beeldvormingssysteem
IVIS SpectrumCT Imaging SystemPerkinElmer, Hopkinton, MAgecombineerd optisch en µCT in vivo beeldvormingssysteem
Living Image SoftwarePerkinElmer, Hopkinton, MABeeldanalysesoftware voor in vivo optisch beeldvorming

Referenties

  1. Dothager, R. S., et al. Advances in bioluminescence imaging of live animal models. Curr Opin Biotechnol. 20, 45-53 (2009).
  2. Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging progress and applications. Trends Biotechnol. 29, 624-633 (2011).
  3. Luker, G. D., Luker, K. E. Optical imaging current applications and future directions. J Nucl Med. 49, 1-4 (2008).
  4. Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and listening to light the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
  5. Reumann, M. K., Weiser, M. C., Mayer-Kuckuk, P. Musculoskeletal molecular imaging a comprehensive overview. Trends Biotechnol. 28, 93-101 (2010).
  6. Snoeks, T. J., Khmelinskii, A., Lelieveldt, B. P., Kaijzel, E. L., Lowik, C. W. Optical advances in skeletal imaging applied to bone metastases. Bone. 48, 106-114 (2011).
  7. Sjollema, J., et al. The potential for bio-optical imaging of biomaterial-associated infection in vivo. Biomaterials. 31, 1984-1995 (2010).
  8. Del Pozo, J. L., Patel, R. Clinical practice. Infection associated with prosthetic joints. N Engl J Med. 361, 787-794 (2009).
  9. Parvizi, J., Adeli, B., Zmistowski, B., Restrepo, C., Greenwald, A. S. Management of periprosthetic joint infection the current knowledge AAOS exhibit selection. J Bone Joint Surg Am. 94, e104(2012).
  10. Arciola, C. R., Campoccia, D., Speziale, P., Montanaro, L., Costerton, J. W. Biofilm formation in Staphylococcus implant infections. A review of molecular mechanisms and implications for biofilm-resistant materials. Biomaterials. 33, 5967-5982 (2012).
  11. Zimmerli, W., Moser, C. Pathogenesis and treatment concepts of orthopaedic biofilm infections. FEMS Immunol Med Microbiol. 65, 158-168 (2012).
  12. Cram, P., et al. Total knee arthroplasty volume utilization and outcomes among Medicare beneficiaries 1991-2010. JAMA. 308, 1227-1236 (2012).
  13. Wolf, B. R., Lu, X., Li, Y., Callaghan, J. J., Cram, P. Adverse outcomes in hip arthroplasty long-term trends. J Bone Joint Surg Am. 94, (2012).
  14. Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS ONE. 5, (2010).
  15. Bernthal, N. M., et al. Protective role of IL-1beta against post-arthroplasty Staphylococcus aureus infection. J Orthop Res. 29, DOI. 1621-1626 (2011).
  16. Niska, J. A., et al. Monitoring bacterial burden, inflammation and bone damage longitudinally using optical and µCT imaging in an orthopaedic implant infection in mice. PLoS ONE. 7, e47397(2012).
  17. Niska, J. A., et al. Daptomycin and tigecycline have broader effective dose ranges than vancomycin as prophylaxis against a Staphylococcus aureus surgical implant infection in mice. Antimicrob Agents Chemother. 56, 2590-2597 (2012).
  18. Niska, J. A., et al. Vancomycin-Rifampin Combination Therapy has Enhanced Efficacy Against an Experimental Staphylococcus aureus Prosthetic Joint Infection. Antimicrob Agents Chemother. 57, 5080-5086 (2013).
  19. Pribaz, J. R., et al. Mouse model of chronic post-arthroplasty infection noninvasive in vivo bioluminescence imaging to monitor bacterial burden for long-term study. J Orthop Res. 30, 335-340 (2012).
  20. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
  21. Kadurugamuwa, J. L., et al. Direct continuous method for monitoring biofilm infection in a mouse model. Infect Immun. 71, 882-890 (2003).
  22. Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J Biomed Opt. 12, 024007(2007).
  23. Kim, M. H., et al. Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution. Blood. 117, 3343-3352 (2011).
  24. Deirmengian, C. A., Lonner, J. H. What's new in adult reconstructive knee surgery. J Bone Joint Surg Am. 94, 182-188 (2012).
  25. Ning, X., et al. Maltodextrin-based imaging probes detect bacteria in vivo with high sensitivity and specificity. Nat Mater. 10, 602-607 (2011).
  26. Panizzi, P., et al. In vivo detection of Staphylococcus aureus endocarditis by targeting pathogen-specific prothrombin activation. Nat Med. 17, 1142-1146 (2011).
  27. van Oosten, M., et al. Realtime in vivo imaging of invasive and biomaterial associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin. Nat Commun. 4, 2584(2013).
  28. Kong, Y., et al. Imaging tuberculosis with endogenous beta lactamase reporter enzyme fluorescence in live mice. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 12239-12244 (2010).

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

In vivo beeldvormingbioluminescente beeldvormingfluorescentiebeeldvormingmicro-CT-beeldvormingorthopedische implantaatinfectieLysEGFP-muizenStaphylococcus aureusbotvolumeanalysechirurgische implantatieoptische reconstructie
Gecombineerd
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.