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DOI:

10.3791/51612

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16. Oktober 2014

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1Orthopaedic Hospital Research Center, Orthopaedic Hospital Department of Orthopaedic Surgery, David Geffen School of Medicine at University of California, Los Angeles (UCLA), 2PerkinElmer, 3Department of Dermatology, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Department of Orthopaedic Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Kombinierte optische und μCT Bildgebung in einem Mausmodell der orthopädischen Implantatinfektion unter Verwendung eines Biolumineszenz-engineered Stamm von Staphylococcus aureus, sofern die Möglichkeit, die Dynamik der bakteriellen Infektion, sowie die entsprechende Entzündungsreaktion und anatomische Veränderungen in den nichtinvasiven und in Längsrichtung zu überwachen Knochen.

Zusammenfassung

Multimodalität Bildgebung hat als gemeinsamen technologischen Ansatz sowohl in der präklinischen und klinischen Forschung eingesetzt entstanden. Fortgeschrittene Techniken, die in vivo optische und μCT-Bildgebung zu kombinieren ermöglichen die Visualisierung biologischer Phänomene in einem anatomischen Zusammenhang. Diese bildgebenden Verfahren kann besonders nützlich sein, um Bedingungen zu untersuchen, die Auswirkungen Knochen. Insbesondere orthopädische Implantat-Infektionen sind ein wichtiges Problem in der klinischen orthopädischen Chirurgie. Diese Infektionen sind schwer zu behandeln, weil bakterielle Biofilme bilden sich auf den fremden Materialien chirurgisch implantiert, was zu anhaltenden Entzündungen, Osteomyelitis und eventuelle Osteolyse des Knochens das Implantat, was schließlich zu Implantatlockerung und Miss Umgebung. Hier wird ein Mausmodell einer infizierten orthopädischen Prothesenimplantat verwendet wurde, das die chirurgische Platzierung einer Kirschner-Draht-Implantats derart eingebunden in einen Markkanal des Oberschenkelknochens, dass das Ende des Implantats ein das Kniegelenk XTended. In diesem Modell LysEGFP Mäusen, einem Mausstamm, der EGFP-Fluoreszenz Neutrophilen wurden in Verbindung mit einem Biolumineszenz-Staphylococcus aureus-Stamm, der natürlicherweise Licht aussendet, verwendet. Die Bakterien wurden in den Kniegelenken der Mäuse vor dem Schließen der Operationsstelle geimpft. In vivo Biolumineszenz-und Fluoreszenzabbildung verwendet, um die bakterielle Belastung und neutrophile Entzündungsreaktion zu quantifizieren sind. Zusätzlich wurde μCT Bildgebung auf der gleichen Mäusen durchgeführt, so daß die 3D-Position der biolumineszenten und fluoreszierende optische Signale können mit den anatomischen μCT Bilder zusammen registriert werden. Um die Änderungen in den Knochen über die Zeit quantifizieren, wurden die äußeren Knochenvolumen der distalen Oberschenkelknochen zu bestimmten Zeitpunkten unter Verwendung eines halbautomatischen Kontur basierend Segmentierungsprozess gemessen. Zusammengenommen ist die Kombination von in vivo Biolumineszenz / Fluoreszenz-Imaging mit μCT-Bildgebung kann besonders nützlich sein, foder die nicht-invasive Überwachung der Infektion, Entzündungsreaktion und anatomischen Veränderungen der Knochen im Laufe der Zeit.

Einleitung

Multimodalität Präklinische Bildgebung Techniken, die die Kombination von optischen und anatomischen Informationen beinhalten ermöglichen die Visualisierung und Überwachung von biologischen Phänomene in 3D 1-4. Seit μCT-Bildgebung ermöglicht die exquisite Visualisierung von Knochenanatomie, mit μCT Bildgebung in Verbindung mit der optischen Abbildung stellt eine einzigartige Kombination, die besonders nützlich für die Untersuchung von Prozessen, die Knochenbiologie 5-7 einzubeziehen sein könnten. Ein Beispiel wäre, diese Techniken verwenden, um orthopädische Implantatinfektionen, die eine verheerende Komplikation nach orthopädischen chirurgischen Verfahren repräsentieren 8,9 studieren. Bakterien Biofilme auf den implantierten Fremdkörper, die das Überleben der Bakterien zu fördern, indem sie als physikalische Barriere, die Immunzellen aus Erfassen der Infektion und blockiert den Zugriff auf Antibiotika die Bakterien verhindert 10,11 dient. Die chronische und persistierende Infektion der Gelenkgewebe (septische Arthritis) eined Knochen (Osteomyelitis) induziert Knochenresorption, die zur Lockerung der Prothese und letztendlich zum Scheitern 8,9 führt. Diese resultierende periprothetischer Osteolyse mit einer erhöhten Morbidität und Mortalität 12,13 verbunden.

In unserer früheren Arbeit, in vivo biolumineszenten und Fluoreszenz-Bildgebung wurde mit Röntgen-und Mikro-Computertomographie-Bildgebung (μCT) in einer orthopädischen Gelenkprotheseninfektionsmodell in Mäusen 14-19 verwendet. Dieses Modell beinhaltete, daß eine Titan-Kirschner-Draht (K-Leitung) in der Weise, daß das abgeschnittene Ende des Implantates im Kniegelenk aus den Oberschenkelknochen von Mäusen 14-19 erweitert. Ein Inokulum von Staphylococcus aureus (Stamm Xen29 biolumineszierende oder Xen36) wurde dann auf die Oberfläche des Implantates im Kniegelenk pipettiert, bevor der Operationsstelle wurde 14-19 geschlossen. In vivo Abbildungsoptik verwendet, um zu detektieren und zu quantifizieren, die Biolumineszenz-Signale, die entsprach der nummer von Bakterien im infizierten Gelenk-und Knochengewebe 14-19. Zusätzlich wird in vivo Fluoreszenzmikroskopie der LysEGFP Mäusen, die Fluoreszenz Neutrophile 20 besitzen, verwendet, um die Anzahl von Neutrophilen, die mit den infizierten Kniegelenke mit den K-Draht Implantate 14,19 wandert quantifizieren. Schließlich anatomischen Bildgebungsmodalitäten, einschließlich hochauflösender Röntgenbildgebung und μCT Bildgebung erlaubt jeweiligen 2D und 3D anatomischen Bildgebung des betroffenen Knochens über die gesamte Dauer der chronischen Infektion, die wir willkürlich in der Regel am Ende zwischen 2 und 6 Wochen nach der Operation 16 , 18. Mit diesem Modell könnte die Wirksamkeit von lokalen und systemischen antimikrobiellen Therapie, schützende Immunantworten und pathologischen anatomischen Veränderungen der Knochen ausgewertet 14-18 werden. In diesem Manuskript wurden die detaillierten Protokolle für die optischen und μCT bildgebenden Modalitäten in diesem orthopädischen Gelenkprothese Infektionsmodell als Vertre bereitgestelltve System, um biologische Prozesse in der anatomischen Zusammenhang der Knochen studieren. Diese schließen die chirurgischen Verfahren, die eine orthopädische Gelenkprothesen-Infektion in Mäusen zu modellieren, 2D und 3D in vivo optischen Bildgebungsverfahren (für bakterielle Biolumineszenz-Signale und Fluoreszenzsignale zu detektieren Neutrophilen) μCT Abbildungserfassung und Analyse und Co-Registrierung von optischen 3D-Bilder mit der μCT Bilder.

Protokoll

Ethik Aussage: Alle Tiere wurden in strikter Übereinstimmung mit der guten Tierpraxis in den Bundesvorschriften, wie in der Tierschutzgesetzes (AWA) eingestellt definiert behandelt, 1996 Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und dem PHS Politik für die Humane Pflege und Verwendung von Labortieren und allen tierischen Arbeit wurde von der Johns-Hopkins-Animal Care und Use Committee (Protokoll #: MO12M465) zugelassen.

1. Vorbereitung des Inokulums von Mid-logarithmischen Biolumineszenz Bakterien

  1. Streak Biolumineszenz S. aureus-Stamm Xen29 (oder einem anderen Stamm, wie bioluminscent Xen36) auf CASO-Agar-Platten (CASO-Bouillon in Agar [1,5%]).
    HINWEIS: S. aureus Xen29 21 ist eine gentechnisch S. aureus-Stamm, der eine modifizierte lux-Operon aus Photorhabdus luminescens, die in einem stabilen nativen Plasmid in dieser Bakterienstamm gefunden integrierte abgeleitet sind. Diese MotorEred Bakterien konstitutiv emittieren Licht von Live-und stoffwechselaktiven Zellen.
  2. Wachsen der Kolonien auf den Platten durch Inkubation bei 37 ° C für etwa 16 h (O / N).
  3. Wählen Sie einzelne bakterielle CFU und Kultur in ca. 16 Stunden (O / N) Schütteln Flüssigkeit TSB (240 UpM).
  4. Durchführen einer Subkultur mit 1:50-Verdünnung des O / N-Kultur bis mittleren logarithmischen Wachstumsphase Bakterien (ca. 2 h Laufzeit) zu erhalten.
  5. Pellet resuspendieren und waschen die Bakterien 3x in PBS.
  6. Schätzung der bakteriellen Inokula (1 × 10 3 CFU in 2 ul PBS) durch Bestimmung der optischen Dichte bei 600 nm Absorption.
  7. Überprüfen Sie die CFU in der Impfstoff nach Kultivierung der Bakterien O / N auf Platten.

2. Maus Chirurgische Verfahren

HINWEIS: Für diese Experiment, mit einem zwölf Wochen alte männliche Mäuse LysEGFP. Diese Mäuse besitzen verstärkt grün fluoreszierende Protein (EGFP) exprimieren myeloiden Zellen (die von m bestehenostly Neutrophile) 20. Pflegen sterilen Bedingungen während der Operation und nach der chirurgischen Vorbereitung mit betadine und 70% Alkohol, indem jede Maus auf einem sterilen Tuch auf einem harten Untergrund zirkulierende Wasser Heizkissen. Verwenden Kleid, sterile Handschuhe, Maske und sterilisieren Instrumente.

  1. Betäuben die Maus mit einer 2% Inhalation von Isofluran. Verwenden Tierarzt Salbe auf die Augen zu Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Bewerten Sie die angemessene Höhe der Anästhesie durch die Beobachtung der Atemfrequenz, Muskeltonus, toe Prise, Hornhautreflex und die Farbe der Schleimhäute. Decken den Mäusen, die mit einem sterilen chirurgischen Abdeckung mit einer Öffnung an der Operationsstelle am rechten Knie. Die Maus sollte stützHeizung Maßnahmen, die Körpertemperatur während der Narkose zu halten bekommen. Warme 37 ° C zirkulierende Wasser in einem warmen Wassermantel Decke oder einem Wasserkreishartplastik beheizten Arbeitsplatz (ProStation, Patterson, Scientific) sind gute Möglichkeiten, um eine Unterkühlung zu verhindern.
  2. Injizieren buprenorphine (Retard-Formulierung) (2,5 mg / kg) subkutan kurz vor der Operation. Zusätzliche Dosen mit verzögerter Freisetzung von Buprenorphin kann in 3 Tage-Intervallen für Analgesie benötigt, verabreicht werden.
  3. Rasieren Sie die Knie und operative prep mit drei Wechsel Peelings mit betadine und 70% Alkohol.
  4. Durchführen einer Mittellinieneinschnitt in der Haut, die über der rechten Kniegelenks. Verlängern Sie die Hautschnitt, so dass der Streckapparat kann auch definiert werden.
  5. Führen Sie eine mediale Arthrotomie parapatellare und sublux die Quadrizeps-Patellasehne Streckapparat seitlich mit einem Adson Pinzette.
    HINWEIS: Dies bringt die Inzisur des Oberschenkelknochens in der normalen Ansicht.
  6. Manuell Ries der Markkanal mit einer 25 G-Nadel, gefolgt von einer 23 G-Nadel.
    Hinweis: Um Schäden zu vermeiden, um Femur, kann eine stabilisierende Plattform verwendet werden. Dies wichtig, die Technik sein, um eine versehentliche Bruch des Oberschenkelknochens zu minimieren.
  7. Legen Sie eine medizinischem Titan Kirschner-Draht (0,8 mm Durchmesser) unter Verwendung einer Press-fit-Technik, die von Hand schieben bringt es mit einem Stifthalter, in einer rückläufigen Richtung in den Markkanal.
    HINWEIS: Titan K-Drähte wurden verwendet, da es weniger Artefakte auf den μCT Bilder mit Titan K-Drähte im Vergleich zu Edelstahl K-Drähte 16 zu sehen.
  8. Schneiden Sie das Ende des Kirschner-Drahtes mit Stiftschneider, so daß das abgeschnittene Ende des K-Drahtes etwa 1 mm in das Kniegelenk Raum erstreckt.
  9. Mit einer Mikropipette, Pipetten 2 ul 1 x 10 3 CFU biolumineszenter S. aureus Xen29 auf die Spitze des Implantats im Kniegelenk Raum.
    HINWEIS: Mehr Volumen führt zu größeren Gewebekontamination und weniger diskrete Bildgebung.
    HINWEIS: In nicht-infizierten Kontrollmäusen, fügen Sie 2 ul steriler Kochsalzlösung ohne Bakterien.
  10. Reduzieren Sie die Quadrizeps-Patella-Komplex zurück zur Mittellinie mit einer Pinzette, und schließen Sie die darüber liegende subkutane Gewebe und die Haut mit resorbierbarensubkutikuläre Nähten.
    HINWEIS: ein Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis er das Bewusstsein wiedererlangt, um ausreichend Brustlage zu halten. Sie ein Tier, das Operation, um der Gesellschaft von anderen Tieren unterzogen wurde, bis vollständig erholt nicht zurück.
  11. Am Ende der Versuche, alle Tiere euthanasiert mit Kohlendioxidinhalation nach der Johns Hopkins Animal Care und Use Committee Richtlinien. Überprüfen Sie, ob der Tod durch die Beobachtung der Tier nicht innerhalb von 10 Minuten nach der Kohlendioxid-Exposition endet und Genickbruch zu erholen.

3. 2D-Optical Imaging (In-vivo-Biolumineszenz und Fluoreszenz-Imaging)

  1. Betäuben LysEGFP Mäusen (zB 2% Isofluran Inhalation) und legen Sie sie mit Bauchseite nach oben in einem bildgebenden Kammer.
  2. Führen Sie in vivo Biolumineszenz-Bildgebung mit dem IVIS Spectrum optische ganze Tier in vivo-Bildgebungssystem. Prüfen Sie zunächst, Leucht und bestätigen Sie die Wahl einer offenen fILTER Auswahl, Sichtfeld (FOV) C - 13 cm, und blättern Sie die Belichtungszeit, um den Auto (Belichtungsautomatik-Einstellung). Belichtungsautomatik wird Akquisitionszeit (Verschlusszeit), Binning (digital Binning) und Blende (Apertur) des Instruments an Signalintensität zu optimieren bei gleichzeitiger Vermeidung der Sättigung automatisch einzustellen. Dann klicken Sie erwerben, um das Biolumineszenz-Bild aufzunehmen.
    HINWEIS: Für die in vivo Biolumineszenz-Bildgebung, Bild Mäuse von 1 - 5 min.
  3. Sequentielle in vivo Fluoreszenz-Bildgebung, indem Sie das Kontrollkästchen neben Leuchtstoff. Wählen Sie die 465 nm Anregungsfilter und 520 nm Emissionsfilter. Blättern Sie Belichtungszeit, um den Auto und wählen FOV C (Schritt 3.2.1). Erwerben Sie dann auf, um die Fluoreszenz Bild aufzunehmen.
    HINWEIS: Für die in vivo Fluoreszenz-Bildgebung, Bild Mäuse zwischen 0,5 sek.
  4. Quantifizierung der in vivo Biolumineszenz-Signale als Gesamtfluss (Photonen / sec) in einer Region of Interest (ROI) mit Wohnzimmer-Image Software, indem Sie zuerst den Ausbau derROI-Tools Abschnitt der Tool-Palette.
    1. Wählen Sie das Kreis-Symbol und die Anzahl der ROIs, die auf die Anzahl der Tiere in der Betreff FOV entsprechen. Die Größe der ROI, die Region von Interesse, dh umfassen, die Biolumineszenz-Diffusionsmuster gesammelt.
    2. Wählen Sie Messen ROIs in ROI-Tools in der Tool-Palette und der ROI Messfenster wird angezeigt. Radiance (Photonen / sec) Werte insgesamt stellen die Summe der Biolumineszenz Pixel innerhalb der ROI generiert.
    3. Wählen Sie die SELECT ALL und kopieren Registerkarten in der unteren rechten Ecke des Fensters werden die Informationen in die Zwischenablage Einfügen in nachfolgenden Programmen zur Analyse übertragen und ermöglichen.
  5. Quantifizierung der in vivo Fluoreszenzsignale als Gesamtstrahlungsleistung ([Photonen / sec] / [uW / cm 2]) in einem kreisförmigen Bereich von Interesse (ROI) mit Wohnzimmer-Image Software.
    1. Innerhalb der Wohn Bild Software-Fenster, erweitern ROI-Tools in der Tool-Palette. Wählendas Kreissymbol und die Anzahl von ROIs, die der Anzahl der Zieltiere im FOV entspricht.
    2. Die Größe der ROI, die Region von Interesse entsprechenden eng mit der Biolumineszenz-Signal aus dem vorherigen Bildaufnahme umfassen.
    3. Wählen Sie Messen ROIs in ROI-Tools in der Tool-Palette und der ROI Messfenster wird angezeigt.
      HINWEIS: Gesamtstrahlungsleistung ([Photonen / s] / [uW / cm 2]) stellt die Summen der Fluoreszenz Pixel innerhalb der ROI.
    4. Alle auswählen und kopieren Registerkarten in der unteren rechten Ecke des Fensters werden die Informationen in die Zwischenablage Einfügen in nachfolgenden Programmen zur Analyse übertragen und ermöglichen.

4. μCT Image Acquisition

  1. Legen Sie die narkotisierten Mäusen LysEGFP in eine Abbildungskammer.
    HINWEIS: Diese Abbildungskammer wurde entwickelt, um sowohl in der IVIS Spectrum Imaging-System und dem Quantum FX in vivo μCT-Bildgebungssystem, damit passenCo-Registrierung der optischen und μCT Bilder.
  2. Öffnen Sie die CT-Software und wählen Sie das Menü voreingestellten 60 mm FOV std dynamische aus der Dropdown.
  3. Legen Sie die große Bohrung Abdeckung und den Adapter Arm für die Abbildung Shuttle in das Instrument.
  4. Platzieren Sie die Maus Imaging-Shuttle in den Adapter Arm drücken Sie dann den Arm in die Bohrung und die Tür schließen. Schalten Sie den Live-Modus (das Auge Taste auf der Systemsteuerung) und positionieren Sie das Motiv in der 0 ° und 90 ° Gantry Position mit der X-Achse und Y-Achse steuert, um das Tier in der X-Capture-Fenster zu zentrieren. Dann schalten Sie den Live-Modus, indem Sie den Eye Button.
  5. Erwerben Sie eine dynamische Scan-Bild mit der 60 mm FOV, indem Sie auf den CT-Scan-Taste (neben dem Live-Modus-Taste). Exportieren Sie die erworbene Bild im DICOM-Format und an einem Ort, der später zugegriffen werden kann.
    Anmerkung: Die ungefähre Dosis 26 mGy pro Scan sein. Eine 30 mm FOV kann verwendet werden, wenn eine höhere Auflösung gewünscht wird.

5.3D Optical Image Acquisition, Formation und μCT Co-Registrierung

  1. Platzieren Sie die Maus Imaging-Shuttle-Einsatz in das Spektrum, indem Sie den Shuttle-Bildgebung, die die Maus in diesem Einsatz und sicherzustellen, dass die Maus nicht bewegen.
  2. Mit Wohnzimmer Bildes wählen Imaging-Assistenten in der Systemsteuerung Nahme, um den Assistenten Setup zu beginnen. Zu starten, wählen Sie Biolumineszenz, dann DLIT, und wählen Sie dann die Reporter "Bakterien" aus dem Dropdown-Menü und die entsprechenden Emissionsfilter für das Modell wird automatisch gewählt werden, in diesem Fall, 500 - 620 nm.
    1. Wählen Sie auf Weiter, dann bezeichnen die Erfassungsparameter und unter Informationen im letzten Fenster. Insbesondere wird Imaging Betreff Maus sein, wird Auto-Einstellungen gewählt werden so dass der Belichtungsautomatik, um die Signalqualität zu maximieren bei gleichzeitiger Vermeidung Sättigung und Field of View wird auf C eingestellt werden - 13cm.
    2. Wählen Sie Fertigstellen der letzten Fenster und das Fenster Reihenfolge der Übernahme-Panel wird einie automatisch mit der Folge DLIT besiedelt. Es wird ein Bild pro gewählt Emissionsfilter und Belichtungsautomatik wird die optimalen Einstellungen wählen bei jeder Wellenlänge nach den Imaging-Assistent Auswahl erworben sein. Die erzeugte Sequenz enthält auch eine strukturierte Leuchte für Thema Flächenerzeugung über die Oberflächentopographie Werkzeug unten beschrieben benötigt.
  3. Wählen Sie Acquire Sequenz, um die Daten zu erfassen DLIT.
  4. Nach der Bildaufnahme abgeschlossen ist, erzeugt die Oberflächentopographie. Starten Sie durch die Erweiterung der Registerkarte Oberflächentopographie unter der Tool-Palette.
    1. Als nächstes wählen Sie die Ausrichtung, die genau spiegelt die Seite des Tieres vor der Kamera oder Oberseite des IVIS Instrument. Dann klicken Sie auf Gene Oberfläche. Zuschneiden der Region des FOV, die das Tier enthält.
    2. Dann nutzen Sie die lila Maske, um die Grenzen des Tieres zu definieren.
      HINWEIS: Das Maskenwerkzeug verwendet Farbkontrast so Tiere mit dunklem Fell oder Haut wird nicht richtig von dem s-Masketage.
    3. Wählen Sie Fertig, und die Oberfläche wird automatisch angezeigt. Speichern Sie das Ergebnis unter dem Reiter Oberflächentopographie schließen Sie dann die Registerkarte als wir nicht mehr brauchen.
  5. Rekonstruktion der optischen 3D-Quellenposition unter Verwendung der in Wohnzimmer Bild 22 durch die Erweiterung der Registerkarte DLIT 3D-Rekonstruktion durchgeführt diffuse optische Rekonstruktionsalgorithmen.
    1. Bilder für die DLIT Sequenz aufgenommen werden angezeigt.
      HINWEIS: Die Software überprüft automatisch die Qualität der erfassten Daten und Bilder deaktivieren als zu schwach oder wo Sättigung vorhanden ist. Wählen Sie Start auf der rechten unteren Seite.
    2. Bei Bedarf kann man die Schwelle für jede Biolumineszenz-Bild mit einem Doppelklick anpassen und mit Hilfe der Schwellenschieberegler auf der unteren linken Seite.
      HINWEIS: Dies ist vor allem auf niedrigere Intensitätssignal und Vorsicht gehören sollte, wenn Schwellen höher, da dies Gesamtintensität des letzten rekonstruierten Quelle einstellen geübt werden.
    3. Wenn mit dem Schwellenwert erfüllt, wählen Sie rekonstruieren die automatische Ausführung der Rekonstruktionsalgorithmen, die in einer 3D-Darstellung der optischen Quelle führt.
  6. Öffnen Sie die DICOM-Browser durch Klicken auf die 3D-Symbol in der Werkzeugleiste am oberen Rand der Software (Dritter von links) und die Suche nach dem Quantum FX Bild zuvor erworben.
    1. Laden Sie dieses Bild in den Wohn Registerkarte Bild 3D-Ansicht mit einem Doppelklick auf die Datei für den Import.
      HINWEIS: Die Bezugs sollte automatisch erkannt und führen zur μCT Bild werden, die mit dem optischen 3D-Bild registriert.
  7. Deaktivieren Sie die Oberflächentopographie Visualisierung Karte erweitert 3D optische Werkzeuge in der Tool-Palette und deaktivieren Sie das Kontrollkästchen Anzeige Betreff Oberfläche in der Registerkarte Oberfläche.
  8. Eine Lookup-Tabelle, um das Skelett und die K-Draht-Implantat, das in der μCT Bild mit dem Histogramm unter der Registerkarte Lautstärke des 3D-Multi-Modali sichtbar visualisieren manuell erstellenty Abschnitt Tools der Tool-Palette.
    1. Das Histogramm zeigt die Verteilung der Voxel-Intensitäten in den 3D-Messdaten und der Farbtrübung. Um festzustellen, wo das jeweilige Gewebe von Interesse ist im Histogramm, verwenden Sie den Schieberegler, Werkzeug, um die Rendering-Schwelle, bis das Gewebe oder die Struktur sichtbar ist.
    2. Klicken Sie dann rechts im Histogramm, um Punkte zu generieren und bilden eine Kurve, um diesen Bereich des Histogramms zu isolieren. Dies wird für jede Struktur wiederholt werden - Skelett gefolgt von der K-Draht-Implantats und kann gespeichert werden als eine Nachschlagetabelle für zukünftige Analysen.
    3. Komponenten können farbcodiert, wenn so mit einem Doppelklick gewünschten jede erzeugte Punkt im Histogramm und die gewünschte Farbe aus der Pop-up-Fenster.

6. μCT Bild Visualisierung und Analyse

  1. Mit Hilfe des Quantum FX-Software, wählen Sie das Bild von Interesse und Viewer starten. Wählen Sie das Drehen-Werkzeug und das Bild neu zu orientieren Visualize der Längsachse des Oberschenkelknochens. Wählen Sie das Messwerkzeug und messen Sie die Länge des Oberschenkelknochens.
  2. Starten Sie die 3D-Viewer, um 3D-Renderings zu erzeugen. Stellen Sie die Schwelle, um die Änderungen in der Knochenanatomie mit Implantat-Infektion zeigen.
  3. Schnittebenen gelten, so dass das 3D-Rendering wird auf das gewünschte Querschnittsabschnitt des Bereichs von Interesse in dem distalen Femur.
  4. Starten Sie das Analysieren 11.0 Software-Paket. Laden Sie die Datei * .vox, die verwendet wurde, um die 3D-Rendering zu erstellen.
  5. Starten Sie das Bild Rechner-Tool. Verwenden Sie das Werkzeug des "Region Pad ', um das Bild zu beschneiden (Flugzeuge, die keine den Oberschenkelknochen entfernen).
  6. Starten Sie die Schrägschnitte Werkzeug. Mit der Option 3 Punkte, Punkte in der Mitte des Femurs Trochanter major und dem Ende des Stifts zu finden. Stellen Sie diese Punkte eine schiefe Ebene und erzeugen ein Bild mit neuen Scheiben.
  7. Starten Sie die Region of Interest-Tool. Zeigen Sie die transaxialen Scheiben schneiden. Stellen Sie die min und max-Einstellungs zu den kortikalen Knochen anzuzeigen. Erstellen Konturen für die entsprechenden Scheiben für ein paar Scheiben (mit einem ungefähren Intervall von 5 Scheiben) für die Scheiben entsprechend der distalen 25% des Femurs. Verwenden Sie das Tool "Propagieren Regionen, zwischen diesen Konturen zu interpolieren, und erstellen Sie eine 3D-Bereich von Interesse. Speichern Sie diese Region von Interesse als ein Objekt Karte.
  8. Starten Sie die "Sample Optionen"-Tool. Wählen Sie das Kontrollkästchen für die Objektkarte, die gerade erstellt wurde, und wählen Sie die Optionsfelder für die entsprechenden Optionen. Klicken Sie auf "Konfigurieren Anmelden Stats"-Taste, um zu bestätigen, dass die 'Lautstärke' Kontrollkästchen aktiviert ist. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Beispielbilder", um die tatsächlichen Messungen.
  9. Exportieren Sie die Volumenmessungen in ein Datenanalyseprogramm. Normalisieren die äußeren Knochenmengen aus späteren Zeitpunkten auf die erste abgebildet Zeitpunkt nach der Formel: Δ Volumen (%) = ([Volume (Tag X) - Volume (Tag 2)] / [Volume (Tag 2)]) x 100 .
    HINWEIS: In dieser Formel ist die Variable "X" steht für die Zeit in der Umgebung. Die resultierende Zahl wird die Änderung in der Größe der äußeren Knochenvolumen des distalen Oberschenkelknochens mit der Zeit darzustellen.
  10. Um den 3D-Bereich von Interesse auf der Oberseite der Knochen sichtbar zu machen, laden Sie das CT-Bild in der "Volume Render"-Tool. Legen Sie das Objekt, das die 3D-Karte Region von Interesse. Gehen Sie zu 'View''Objects' und stellen Sie die "Original" auf "On" zu sein. Öffnen Sie das Fenster "Vorschau". Starten Sie das Menü "Rendertypen" und wählen Sie "Objekt Compositing".
  11. Klicken Sie auf den "Threshold"-Taste und Werkzeug und stellen Sie die Schwellenwerte, um den Knochen und Objekt Karte anzuzeigen. Verwenden Sie den gleichen festen Schwellenbereich für alle Zeitpunkte. Klicken Sie auf die 'Rotation' Taste, und stellen Sie die Ausrichtung auf eine wahre anterolateralen Ansicht sein. Klicken Sie auf "Rendern", um das finale Rendering zu erzeugen. Speichern Sie das Rendering von der Haupt 'VolumeRender "Fenster.

Ergebnisse

In-vivo-Biolumineszenz-und Fluoreszenzabbildungs

In der vorliegenden Studie wird das Protokoll für diese bereits veröffentlichten Modell einer orthopädischen Gelenkprothesen Infektion in Mäusen 14-19, die die chirurgische Platzierung einer Titan-K-Draht-Implantat, das aus einem Knochenmarkkanal in die Fuge erstreckt sich in den Femur umfasst beschriebene Platz 14-19. S. aureus Stamm biolumineszenten Xen29 (1 × 10 3 CFU in 2 ul PBS) wurde direkt auf die Oberseite des Endes Titanimplantat in das Kniegelenk vor dem Schließen der Operationsstelle 16 pipettiert. Zu visualisieren und zu quantifizieren, die bakterielle Belastung und Neutrophileneinstrom nichtinvasiv an narkotisierten Mäusen LysEGFP, wurde in vivo ganze Tier optische Bildgebung für Bild nacheinander durchgeführt die Biolumineszenz-Signale von den Bakterien und die EGFP Fluoreszenzsignale aus den Neutrophilen infiltriert mit dem IVIS Spectrum optische ganze Tier in vivoAbbildungssystem auf drei Tage nach der Operation (dh den Tagen 2, 14 und 28). Die Biolumineszenz-Signale Xen29-infizierten Mäusen blieb über Hintergrundsignale von Schein-infizierten Mäusen für die Dauer des Experiments (1A, C) 16. Unserer früheren Arbeit zeigten, daß die in vivo-Biolumineszenz-Signale genau die Zahl der ex vivo CFU vom Gelenk / Knochengewebe isoliert und haft den Implantaten 17,18 angenähert. Darüber hinaus wurden die EGFP Fluoreszenz-Signale höher als Schein-infizierten Mäusen zu frühen Zeitpunkten, sondern näherte Hintergrundwerte im Verlauf der Infektion (Abbildung 2B, C) ​​16.

3D-Co-Registrierung von in vivo optische Signale mit μCT Bilder

Um die optischen Signale (dh bakterielle Biolumineszenz-und EGFP-Fluoreszenz-Signale) im anatomischen Kontext der postoperativen Kniegelenke visualisieren in 3D, waren die optischen Bilder die unter Verwendung des IVIS Spectrum Imaging-System Co-registriert mit μCT Bilder erzeugt mit Hilfe des Quantum FX μCT-Bildgebungssystem. Diese Co-Registrierung kann erreicht werden, weil die Maus Abbildungskammer kann entweder in Maschinen eingefügt, um sicherzustellen, dass die Mäuse in der exakt gleichen Ausrichtung sein. Um diese Genauigkeit zu verifizieren, wurden die Ergebnisse mit einer Bildaufnahme unter Verwendung des IVIS Spectrum-CT in vivo-Bildgebungssystem, die beiden Modalitäten in einem Gerät integriert, ohne die physikalische Verlagerung des Tieres. Um die optischen Daten auf die μCT-Bilder in 3D abzubilden, verwendeten wir eine diffuse optische Tomographie Rekonstruktionsalgorithmus 16. Die resultierende 3D-Rekonstruktion dargestellt (Film 1).

Darüber hinaus μCT Bildgebung erlaubt die Visualisierung und Quantifizierung der Folgeänderungen in der Qualität und Abmessungen der Knochen, die während aufgetretender Infektion (Figur 2) 16. Wie bereits berichtet, die äußere Knochenvolumen des distalen Femurs im wesentlichen über die Zeit erhöht (2A) 16. Um diese Veränderungen zu quantifizieren, wurde die volumetrische 3D Bildanalyse auf der distalen 25% der knöchernen Oberfläche des Femurs durchgeführt, und die Veränderungen in der Knochenvolumen im Laufe der Zeit wurden normalisiert auf die Anfangsknochenvolumens. Die äußere Knochenvolumen im wesentlichen in infizierten Mäusen im Vergleich zu Schein-infizierten Mäusen (2B) 16 erhöht. Der Anstieg im distalen Femur äußeren Knochenvolumen war aufgrund von Knochenschäden durch die Infektion der Gelenkgewebe und Knochen, die mit μCT Bildgebung und histologische Analyse 16 beobachtet wurden, verursacht wahrscheinlich.

figure-results-1
Abbildung 1. 2D in vivo Biolumineszenz-und Fluoreszenzsignale. S. aureus Xen29 oder keine Bakterien (nicht infizierten) in das Kniegelenk nach K-Draht-Anordnung und LysEGFP Mäuse wurden mit dem IVIS Spectrum Abbildungssystem 16 abgebildet wird, inokuliert. (A) verstanden, in vivo Biolumineszenz-Signale, wie durch Gesamtfluss (Photonen / sec) gemessen ± SEM. (B) Mittelwert in vivo EGFP Fluoreszenzsignale wie von Gesamtstrahlungsleistung (Photonen / s) gemessen / (uW / cm 2) ± SEM. (C) Vertreter in vivo Biolumineszenz-und Fluoreszenzsignale auf eine Schwarz-Weiß-Fotoüberlagert Bild der Mäuse. Die Nachweisgrenze der bakteriellen Belastung unter Verwendung von in vivo-Biolumineszenz-Bildgebung zwischen 1 x 10 2 und 1 × 10 3 CFU. * P <0,05, † p <0.01, ‡ p <0,001 Xen29-infizierten Mäusen im Vergleich zu schein-infizierten Mäusen (Student-t-Test [two-tailed]). BitteHinweis Dies ist eine repräsentative Figur, die zuvor veröffentlicht mit Xen29 erzeugt und mit dem IVIS Lumina XR-Bildgebungssystem 16 abgebildet Daten enthält. klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

figure-results-2
Abbildung 2. 3D μCT Bildgebung. S. aureus Xen29 oder keine Bakterien (nicht infizierten) wurden nach dem K-Draht Platzierung in das Kniegelenk eingeimpft und Mäusen wurden unter Verwendung der Quantum FX in vivo μCT System abgebildet. (A) Repräsentative 3D-Renderings von μCT Xen29 infizierten Mäusen (obere Felder) und schein-infizierten Mäusen (untere Felder). (B) Anteil der äußeren Knochenvolumenänderung (distal 25% der Oberschenkelknochen) normiert auf den ersten timich Punkt (Mittelwert ± SEM). * P <0,05, † p <0.01, ‡ p <0,001 Xen29-infizierten Mäusen im Vergleich zu schein-infizierten Mäusen (Student-t-Test [two-tailed]). Bitte beachten Sie, dies ist eine repräsentative Figur, die zuvor veröffentlicht erzeugten Daten mit Hilfe des Biolumineszenz-Stamm S. beinhaltet aureus Xen29 und mit der Quantum FX in vivo μCT Abbildungssystem 16 abgebildet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Film 1 . Repräsentative anatomische 3D-Co-Registrierung der Xen29 Biolumineszenz-Signale und die EGFP-Neutrophilen-Fluoreszenzsignale in Kombination mit den μCT Bilder. Die Bilder werden auf der vertikalen Achse gedreht wird.

Diskussion

Multimodalität Bildgebung, wie bildgebende Verfahren, die in vivo optische Bildgebung in Verbindung mit μCT Bildgebung nutzen eine neue technologische Ansatz, der die 3D-Visualisierung, Quantifizierung und Überwachung der Längs biologischen Prozesse in einem anatomischen Zusammenhang 1-4 erlaubt. Die Protokolle in der vorliegenden Studie bieten detaillierte Informationen, wie in vivo Biolumineszenz-und Fluoreszenz-Imaging mit μCT Bildgebung in einer orthopädischen Prothesenimplantat Infektionsmodell in Mäusen kombiniert, um die bakterielle Belastung, neutrophile Entzündung und anatomische Veränderungen im Knochen nicht-invasiv und in Längsrichtung über überwachen Zeit. Zusammen, die durch die Kombination von optischen und strukturellen Bildgebung gewonnenen Informationen stellt einen großen technologischen Fortschritt, die sein können, besonders gut geeignet, um biologische Prozesse und pathologischen Bedingungen, die den Bewegungsapparat beeinflussen zu studieren.

Ein Interesseing Feststellung, dass darauf hingewiesen werden sollte, ist, dass wir beobachtet, dass die EGFP-Neutrophilen Fluoreszenzsignale verringert wird, um Hintergrundwerte von 14-21 Tagen und blieb auf Hintergrundwerte für die Dauer des Experiments, obwohl die Anwesenheit von biolumineszenten Bakterien. Es ist unwahrscheinlich, dass die Röntgenstrahlung beeinflusst Neutrophilen Überleben beobachteten wir ähnliche Kinetik der Neutrophilen-Signale in nicht-bestrahlten Mäusen 19. In unseren früheren Arbeiten, bei denen ein Modell von S. aureus infizierten Wunden, beteiligt neutrophile Infiltration eine Kombination aus robusten Neutrophilenrekrutierung aus dem Kreislauf, verlängert das Überleben von Neutrophilen an den Ort der Infektion und dem Homing von KIT + Vorläuferzellen an der Abszess, wo sie vor Ort führen zu Neutrophilen 23 reifen. Es ist wahrscheinlich, dass ähnliche Prozesse beigetragen Neutrophilen-Infiltration in der orthopädischen Implantat S. aureus-Infektionsmodell. Obwohl es nicht bekannt ist, warum die Neutrophilen Signale im Orthop verringerteaedic Infektionsmodell könnte es sein, dass die Immunantwort über die Zeit verändert, wie dies voran Infektion von einer akuten zu einer chronischen Infektion und dies ist ein Gegenstand zukünftiger Untersuchungen.

Es gibt Einschränkungen mit diesem Mausmodell der orthopädischen Gelenkprothese Infektion und der In-vivo-Bildgebung, die Multimodalität beachtet werden sollte. Erstens ist dies eine zu starke Vereinfachung Maus-Modell der aktuellen Verfahren und Materialien in der orthopädischen Chirurgie bei Menschen 24 verwendet. Dennoch tut dies Modell rekapitulieren die chronische Infektion und die daraus resultierenden Entzündung im Knochen-und Gelenkgewebe, das in der menschlichen orthopädischen Implantatinfektionen 8,9 zu sehen ist. Zusätzlich zu den μCT Bilder zu erhalten, wurden relativ niedrige Dosen von Röntgenstrahlung verwendet, um negative Auswirkungen auf die Gesundheit der Tiere im Verlauf der Infektion zu minimieren. Für eine bessere Auflösung von Knochen, höhere Dosen von Röntgenstrahlung könnte für μCT Bildgebung verwendet werden eingeschläfert auf einnimals. Dies würde jedoch die Möglichkeit zu beseitigen, um die Knochenveränderungen über die Dauer der Experimente nicht-invasiv und in Längsrichtung überwacht.

Im Ergebnis hat die multimodale Bildgebung, die die Kombination von In-vivo-Tier ganze optische Bildgebung mit anatomischen Bildgebung μCT umfassendere Informationen über die Infektion und entzündliche Reaktion erlaubt. Außerdem haben diese Techniken die Auswertung der Folgen der Infektion und Entzündung an der Knochen-und Gelenksgewebe erlaubt. Zukünftige Arbeiten könnten sich die Vorteile der Multimodalität Bildgebung zu ergreifen, um die Wirksamkeit von antimikrobiellen Therapien, Immunreaktionen, Pathogenese der Krankheit und den reaktiven Veränderungen im Knochen zu bewerten, wie wir begonnen haben, 14-18 zu untersuchen. Darüber hinaus könnte die multimodale Bildgebungssonden und Tracer zu evaluieren, das Vorliegen einer Infektion zu diagnostizieren, wie zuvor in Tiermodellen eine Oberschenkel-Infektion, Endocarditis, Lungen InfectIonen und Biomaterial-Infektionen 25-28. Schließlich könnte der Einsatz der multimodalen Bildgebung über Infektionskrankheiten erweitert und zwischen den Disziplinen, einschließlich Orthopädie, Rheumatologie und Onkologie verwendet werden, um andere Bedingungen zu untersuchen, die auf das Muskel-Skelett-System, wie Skelett Krebs, Metastasen, Frakturen und Arthritis 5-7 .

Offenlegungen

JAM, BNT, EL, NZ, KPF sind bezahlte Mitarbeiter von PerkinElmer, die die Bildgebung Instrumente produziert, sofern die Xen29 Biolumineszenz S. aureus-Stamm, und für die Kosten der Veröffentlichung dieses Videos-Artikel bezahlt. Die übrigen Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von einer H & H Lee Surgical Resident Research Scholars Program (JAN), unterstützt ein AO Foundation Gründungszuschuss S-12-03M (LSM) und ein National Institutes of Health Zuschuss R01-AI078910 (LSM) .

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Xen36 biolumineszierender Staphylococcus aureus-StammPerkinElmerBiolumineszierender Staphylococcus aureus-Stamm, abgeleitet von ATCC 49525 (Wright), einem klinischen Isolat aus einem Bakteriämie-Patienten
Franklin Lakes, NJ214010
LysEGFP Knockin-MausstammNicht im Handel erhältlich. Dieser Stamm enthält ein Knockin von verstärktem grünem Fluoreszenzprotein (EGFP) in das Lysozym-M-Gen
BetadinePurdue Products, Stamford, CT
Kirschner-Draht (Titan, 0,8 mm Durchmesser)Synthes, West Chester, PA492.08
Drahtschneider - Duracut T.C.H& H Company, Ontario, Kanada83-7002
IsofluranBaxter, Deerfield, IL118718
Vicryl 5-0 Nahtmaterial (P-3 Reverse Cutting)Ethicon, Summerville, NJ. Erworben über VWR International.95056-936
Buprenorphin mit verzögerter Freisetzung (5 ml - 1 mg/ml)Zoopharm, Windsor, COAnalgetikum
IVIS Spectrum Imaging SystemPerkinElmer, Hopkinton, MAoptisches In-vivo-Bildgebungssystem
Quantum FX in vivo µ CT-SystemPerkinElmer, Hopkinton, MAµ CT in vivo Bildgebungssystem
IVIS SpectrumCT BildgebungssystemPerkinElmer, Hopkinton, MAkombiniert optisch und µ CT in vivo Bildgebungssystem
Living Image SoftwarePerkinElmer, Hopkinton, MABildanalysesoftware für die optische In-vivo-Bildgebung
Tryptische Sojabrühe BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ 211825 Bacto Soja-Agar BD Biosciences,

Referenzen

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