ここでは、動物被験者の細胞および細胞内レベルでの生理現象を理解するための革新的なモードを提供する、ファイバー共焦点蛍光顕微鏡法(FCFM)ベースのイメージングの方法について説明します。
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この記事について
サマリー
要約
化学療法の特定のクラスは、血管の罹患率のリスク増加に患者を素因となることが、長期的な条件に進行することが急性血管の変化を及ぼすことがあります。しかし、取り付け臨床的証拠とはいえ、そこに血管毒性の明確な研究の不足があり、したがって、血管/心臓血管障害の異質グループの病因はまだ解明されていない。また、血管毒性を根底にある機構は、完全に筋細胞傷害を誘導するように関連して、化学療法誘発性の心毒性の原理と異なっていてもよい。我々は、抗癌治療の潜在的な急性血管毒性を評価するために、生体内分子イメージングプラットフォーム 、リアルタイムを確立した。
私たちは、限られた臓器内の血管系を可視化するのに適したマウスでのin vivoで 、高解像度の分子イメージング、および参照BLOのプラットフォームを設定している各個人が自身の対照として役立つのに対し、同じ個人内のOD船。血管壁は、エンド臓器損傷の初期事象かもしれ血管毒性のユニークなメカニズムを表す、ドキソルビシン投与後に損なわれた。本明細書において、繊維質の共焦点蛍光顕微鏡（FCFM）ベースのイメージングの方法は、動物被験体における細胞および細胞下レベルでの生理学的現象を理解するために革新的なモードを提供する、記載されている。
概要
臨床的証拠は、化学療法のいくつかのクラスは、レイノー現象、高血圧、心筋梗塞、脳血管発作、および肝静脈occlusivedisease 1,2によって明らかに血管の病理の多様を引き出すことを示しています。 「「偶発的」抗血管形成薬」が本来そのために3-5のために開発されたが、わずか「担保を課すことにより、腫瘍細胞を排除するように設計されていないが、可能性の血管新生阻害剤として作用する従来の化学療法剤を記載比較的新しい用語である可能な3として正常細胞へのダメージ」。血清バイオマーカーを用いた臨床試験で観察されたように、いくつかの化学療法はvasculo-毒物として暗示されています。これらのうち剤（例えばシクロホスファミドなど）、白金（シスプラチンなど）の化合物およびアントラサイクリン1,2,5-7アルキル化されている。
急性心血管合併症がresulとして発生する可能性があります化学療法によって誘発される血管毒性のトン。彼らは遅く、血管罹患率のリスク増加のためのアテローム性動脈硬化症およびアカウントのような慢性疾患に進行することがある。しかし、取り付け臨床的証拠にもかかわらず、指定された研究の血管毒性のメカニズムを強調し、したがって、それらが与える正確な病因のさらなる解明が保証さの不足がある。
化学療法誘発血管毒性のメカニズムを明らかにすることで主要な課題は、 生体内で血管機能を調査する複雑さに由来する。我々は、ここで血流および船舶の特性を捕捉することができ、マウスにおけるインビボ分子イメージングにおける高分解能のプラットフォームを記述する。リアルタイムで、並びに同じ個体内の時間の期間にわたって、それらを以下：このプラットフォームは、直接処理により誘導される血管作用の検出を容易にする。
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プロトコル
倫理声明：すべての実験は、施設内動物管理使用委員会によって承認された。動物のケアは施設のガイドラインに従ってた。 ICR雌マウス（7から8週齢、25〜30グラム）はテルアビブ大学医学部のサックラー学部、エアコン、光制御動物施設に収容した。用語で、動物を麻酔の過剰投与で安楽死させた。
1. Fibred共焦点蛍光顕微鏡（FCFM）校正
- デバイスの電源を入れます。
- マイクロプローブ（mini0 / 30）を接続します。
- 製造元の指示に従ってデバイスのキャリブレーション。
2.マウスイメージングのための準備
- 両方のKetaset（100mg / kg）およびXYL-M2（6ミリグラム/ kg）を皮下注射することにより麻酔。つま先ピンチに無反応によって適切な麻酔を確認します。
- するために、脚の付け根下の皮膚を切開大腿動脈血管を明らかにする。切開以下の生理食塩水で湿った切開部位にしてください。
- バッグ（または手袋）を使用して尾を熱し、約30秒間（触れないほど熱くない）暖かい水で満たされた。尾静脈に注射針（30 G、1/2インチ）を挿入し、これに1mlシリンジを取り付けることにより、FITCデキストラン（造影剤）の生理食塩水または化学療法剤のいずれかの投与のための静脈内（IV）シャントを準備。静脈が生理食塩水を注入して開いていることを確認。
注：FITCデキストランのIV投与（高分子量; 100μL; 10 mg / mlの、2000 kDa）がFCFMによる大腿骨微小血管系を可視化が容易になります。ドキソルビシン（100μlを、8 mg / kgを、アドリアマイシン）又は生理食塩水は、後述予熱した尾静脈にIVで投与される。 - ポリスチレンステージ上に仰向けにマウスを置きます。パッドにマウスを固定し、外科ダクトテープを使用して位置を維持する。
注：（1）マイクロプローブ（mini0 / 30）本研究で使用した繊維質の共焦点顕微鏡は、二つのユニットから構成されている。 （2）レーザスキャニングユニット（LSU-488;波長488nm）。
- LSU 488 nmの波長のレーザーを使用して分析し、すべての時間のラップを実行します。
注記：メインユニット検出器をろ過検出する（500から650 nm）を発する蛍光を。取得した画像は、その後、再構成及び12フレーム/秒の速度で表示されます。 - 針から慎重に注射器を外し、FITCデキストランを含む新しいシリンジを取り付けます。 FITCデキストランの（IV）100μLを管理します。
- 対応する画像を得るために、z軸調整後、ビューの適切なフィールドへのマイクロプローブ（mini0 / 30）にシフトして固定する。明確な集束信号がVISIになるまでフェードアウトするための最初のシグナルを待つBLE。
- 短い安定化期間（〜30秒）のベースラインの血流を記録します。その後、ドキソルビシンまたは生理食塩水のいずれかを含む、針に別のシリンジを接続します。 IV100μlのドキソルビシンまたは生理食塩水を投与し。
- 20分間連続的に注入FITC-デキストランの流れを監視します。 FCFM関連ソフトウェアでは、血管を測定するために、上部のルーラー上の直径ボタンを使用して分類し、それらのような小さな（<15ミクロン）または大（> 15ミクロン）。
- 麻酔過剰摂取で動物を安楽死させる。
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結果
リアルタイムでの生体内連続撮影では、
ここで使用される撮像装置は、脈管構造および化学療法などの種々の刺激に対する応答の可視化を可能にするプローブを備えた共焦点顕微鏡を、繊維質、高精細である。この方法は、深い血管または器官の画像化を容易にすることができるが、それはプローブのための小さな切開を必要とするので、低侵襲性である。プローブの束は、繊維の数万、顕微鏡光学系と独自の精密コネクタで構成されています。概略図を図1に示されている。
大腿骨微小血管系のイメージング
FCFMによるFITC-デキストランを注射したマウスで、私たちは、血管径（15μmの小<大さ15μm>）によると、大腿血管系のネットワークを分類している。急速な血管収縮 - 小血管の（2~5分）、ドキソルビシンによって誘導された。完全なdisappearanFITC-デキストラン蛍光、8分後ドキソルビシン処理（; ビデオ1、図2（a...
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ディスカッション
化学療法誘発性血管毒性を評価することにより、リアルタイムでの刺激に応答して血管系の動態を可視化が困難であるため困難である。多くの臨床研究が、いくつかの化学療法は、直接血管損傷を引き起こすことを示唆されている、まだこの毒性のメカニズムと特性はまだ解明されていない。私たちはここに8-10説明したように繊維質共焦点蛍光顕微鏡の構成マウスでの化学療法の潜在的な血管の毒性を評価するための生体内分子イメージングプラットフォームでは 、リアルタイムを確立しています。マウスのこの高解像度の分子イメージングは、動脈の血流および船舶のアーキテクチャを視覚化するのに適している。これは、長時間にわたって同じ動物における治療誘発性合併症のリアルタイム検出を可能にする。我々は、化学療法の2つのクラスを評価： インビトロでならびに組織内の内皮細胞に対して毒性であることが知られているドキソルビシンドキソルビシン10-15、および任意の血管効果の元証拠は非常に限られている制御化学療法としてパクリタキセルで処理した動物から得られたS。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 全身麻酔 | Fort Dodge Animal Health, IA, USA and Biove Laboratories, France | 100 mg/kg ketaset and 6 mg/kg XYL-M2 | |
| depilatory cream (Veet) | ReckittBenckiser, Bristol, UK | ||
| 30 G, 1/2 インチ 針 1 ml シリンジ | |||
| FITC デキストラン (10 mg/ml;MW 2,000 kDa) | シグマ | FD2000S | 100 μl 容量 |
| ドキソルビシン | テバ、イスラエル | 8 mg/kg、アドリアマイシン | |
| パクリタキセル | タロイ、イスラエル | 1.2 mg/kg、メデクセル | |
| 生理食塩水 |
参考文献
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