واستخدمت نباتات التبغ لإنتاج سلولاز الفطرية، TrCel5A، عبر نظام التعبير عابر. ويمكن رصد التعبير باستخدام انصهار بروتين الفلورسنت، واتسم نشاط البروتين التعبير آخر.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التعبير عن المؤتلف سلولاز Cel5A من
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الانزيمات المهينة السليلوز، السليلوزات، هي أهداف كل من البحث والمصالح الصناعية. كثرة هذه الإنزيمات في إلى ثقافة الصعب الكائنات الحية، مثل الفطريات بناء خيوط والبكتيريا اللاهوائية، وقد سارعت استخدام التكنولوجيات المؤتلف في هذا المجال. طرق التعبير النباتية هي نظام مرغوب فيه لإنتاج على نطاق واسع من الإنزيمات وغيرها من البروتينات مفيدة صناعيا. هنا، وأظهرت وسائل للتعبير عابر لendoglucanase الفطرية، الترايكوديرما reesei Cel5A، في نيكوتيانا تبغ. ويرد ناجحة التعبير البروتين، ومراقبتها من قبل مضان باستخدام انصهار بروتين mCherry انزيم. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام مجموعة من الاختبارات الأساسية لدراسة نشاط T. أعرب عابر reesei Cel5A، بما في ذلك SDS-PAGE، النشاف الغربية، zymography، فضلا عن مضان والركيزة المقايسات تدهور قائم على الأصباغ. النظام المذكور هنا يمكن أن تستخدم لإنتاج الخلية النشطةulase في فترة زمنية قصيرة، وذلك لتقييم إمكانية زيادة الإنتاج في النباتات من خلال نظم التعبير التأسيسية أو محرض.
المقدمة
وقد تصور تدهور الكتلة الحيوية اللجنوسليلوزية وتحولها إلى وقود سائل كوسيلة للحد من الاعتماد على الوقود الأحفوري. واحد عقبة كبيرة في إنشاء نظم معالجة الكتلة الحيوية غير مجدية اقتصاديا في تدهور الأنزيمية من السليلوز وهيميسيلولوز 1. تظهر أنظمة التعبير النبات إمكانات كبيرة لإنتاج الإنزيمات على نطاق صناعي. يتم تأسيس نظم الزراعية للنباتات الحصاد واقتصاديا في حجم بالفعل، كما كانت منذ آلاف السنين. إنتاج السليلوزات في النباتات غير المرغوب فيه بسبب عوامل مثل سهولة حلمهة ذاتية 2، وإمكانية تعظيم الاستفادة من انخفاض مستويات إنزيم عن طريق زيادة هضم جدران الخلايا النباتية 1. أخيرا، مصنع أنظمة تسمح استهداف....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. النمو البرية نوع N. تبغ النباتات
- أن ينمو N. تبغ L. السيرة الذاتية. النباتات بيتي هافانا SR1 على التربة ووضع البذور التبغ على الأواني المناسبة مليئة تربة طبيعية للإنبات. 2 بعد أسابيع، ونقل الشتلات إلى الأواني الفردية. احتضان النباتات في الدفيئة مع ثابتة 22 درجة مئوية (الفترة المظلمة) أو 25 درجة مئوية (الفترة ضوء) و 70٪ رطوبة الهواء النسبية. توفير الإضاءة في 16/8 ساعة ضوء / دورة الظلام (مثل فيليبس مصابيح IP65 400 واط؛ 180 ميكرومول · · م -1 ثانية -2؛ λ = 400-700 نانومتر) والماء يوميا. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وأعرب عن TrCel5A وTrCel5A-mCherry بنجاح في نباتات التبغ باستخدام نظام التعبير عابرة (أرقام 1A و 1B). النظر في نمط التعبير عن بروتين الانصهار TrCel5A-mCherry كشفت أوراق صحية (الشكل 1C)، والذي أظهر نطاق واسع تعبير البروتين تحت الضوء الأخضر (الشكل 1D).
تم إجراء استخراج مجموع البروتينات القابلة للذوبان في نباتات التبغ التي كانت الأوراق التي تحتوي على.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
التعبير المؤتلف من السليلوزات هو مجال اهتمام كبير، ويرجع ذلك إلى الرغبة في نظم أكثر كفاءة إنتاج الوقود الحيوي 1. النباتات تقدم العديد من الإمكانيات لإنتاج سلولاز ناجحة، مع ميزات مثل تقنيات الحصاد الاقتصادي وأساليب حلمهة ذاتية كونها خصائص مرغوبة جدا لإنتاج الوقود الحيوي على نطاق واسع. أبعد من ذلك، استخدام تعريب مختلفة لإنتاج البروتينات تسمح، إذا لزم الأمر، والتعديلات ما بعد النقل 20. تغيير النباتات لتمكين التعبير التأسيسية للالسليلوزات، في حين تقدم فوائد واضحة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل BMBF Forschungsinitiative "BIOENERGIE 2021 - Forschung FÜR يموت Nutzung فون Biomasse" والكتلة التميز "الوقود مصممة خصيصا من الكتلة الحيوية"، الذي يتم تمويله من خلال مبادرة التميز من قبل الحكومات الاتحادية وحكومات الولايات الألمانية لتعزيز العلوم والبحث في الجامعات الألمانية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 4-methylumbelliferyl & beta ؛ -D-cellobioside | SIGMA-ALDRICH | M6018 | |
| حمض الخليك | ROTH | 3738 | |
| Acetosyringon (مركز) ROTH | 6003 | ||
| مضاد حيوي - كاناميسين | ROTH | T832 | |
| مضاد حيوي - ريفامبيسين | ROTH | 4163 | |
| مضاد حيوي - كاربينيسيلين | روث | 6344 | |
| الجسم المضاد - الأرانب المضادة له(6) pAb | ROCKLAND | 600-401-382 | |
| الأجسام المضادة - الماعز المضادة للأرانب AP ، FC pAb | DIANOVA | 111-055-008 | |
| Azo-carboxymethyl cellulose | MEGAZYME | S-ACMC | |
| & beta - سيكلودكسترين | SIGMA-ALDRICH | C4805 | |
| ثنائي هيدرات | كلوريد الكالسيومSIGMA-ALDRICH | C5080 | |
| كربوكسي ميثيل السليلوز | ROTH | 3333.1 | |
| السليولاز من Trichoderma reesei< / em> ATCC 26921 | SIGMA-ALDRICH | C2730 | |
| الكونغو الأحمر | SIGMA-ALDRICH | 75768 | |
| Coomasie الأزرق اللامع G 250 | ROTH | 9598.2 | |
| D (+) -الجلوكوز | ROTH | 8337 | |
| الإيثانول | ROTH | K928 | |
| - ورق نشاف Rotilabo | ROTH | CL67 | |
| NBT / BCIP | SIGMA-ALDRICH | 72091 | |
| MES buffer | ROTH | 4256 | |
| Methanol | ROTH | 8388 | |
| سترات الصوديوم | ROTH | 3580 | |
| دوديسيل كبريتات الصوديوم | SERVA | 20765 | |
| هيدروكسيد الصوديوم | ROTH | 6771 | |
| التربة ، Einheitserde classic ؛ | PATZER GMBH | ||
| - Infinite M200 | TECAN | ||
| Sucrose | SIGMA-ALDRICH | S-5390 | |
| 4-Hydroxy benzhydrazide | SIGMA-ALDRICH | H9882 | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات | ROTH | 1058 | |
| مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية - BLAK RAY | UVP | ||
| Vibratome - VT1000S | Leica |
المراجع
- Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms. Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).
- Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
