צמחי טבק ששימשו להפקת cellulase פטרייתי, TrCel5A, באמצעות מערכת ביטוי חולפת. הביטוי יכול להיות במעקב באמצעות חלבון היתוך ניאון, ופעילות החלבון התאפיינה הודעה ביטוי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ביטוי של רקומביננטי Cellulase Cel5A מ
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
אנזימים משפילים תאית, cellulases, הם מטרות של שניהם אינטרסים תעשייתיים מחקר ו. העליונות של אנזימים אלה באורגניזמים קשים לתרבות, כגון פטריות העובש בנייה וחיידקים אנאירוביים, שהחישה את השימוש בטכנולוגיות רקומביננטי בתחום זה. שיטות ביטוי צמח הן מערכת רצויה לייצור בקנה מידה גדולה של אנזימים וחלבונים באופן תעשייתי שימושיים אחרים. בזאת, שיטות לביטוי החולף של endoglucanase פטרייתי, Trichoderma reesei Cel5A, בNicotiana tabacum הם הפגינו. ביטוי חלבון מוצלח מוצג, פיקוח על ידי הקרינה באמצעות חלבון היתוך mCherry-אנזים. בנוסף, סדרה של בדיקות בסיסיות המשמשות לבחון את הפעילות של ט 'הביע transiently reesei Cel5A, כולל-SDS, מערבי סופג, zymography, כמו גם הקרינה ומבחני השפלה מצע מבוסס צבען. המערכת המתוארת כאן יכולה לשמש לייצור תא פעילulase בתקופת זמן קצר, על מנת להעריך את הפוטנציאל לייצור נוסף במפעלים באמצעות מערכות ביטוי מכוננות או מושרה.
מבוא
השפלה של ביומסה lignocellulosic והמרתו לדלק נוזלי כבר חזתה כשיטת להפחתת תלות בדלקים מאובנים. המשוכה משמעותית אחד בהקמת מערכות לעיבוד ביומסה מבחינה כלכלית היא בשפלה האנזימטית של תאית hemicellulose 1. מערכות ביטוי צמח מראות פוטנציאל גדול לייצור של אנזימים בקנה מידה תעשייתי. מערכות חקלאיות לצמחי יבול מבחינה כלכלית ובנפח כבר הוקמו, כפי שהם היו במשך אלפי שנים. הייצור של cellulases בצמחים רצוי בשל גורמים כמו קלות autohydrolysis 2, ואת הפוטנציאל למקסם את השימוש ברמות אנזים נמוכים יותר על ידי הגדלת הנעכלות של קירות תא צמח 1. לבסוף, מערכות מפעל מאפשרות את המיקוד של חלבונים רקומביננטי לאזורים הספציפ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. צמיחה של צמחי tabacum נ סוג בר
- לגדול נ tabacum L. קורות חיים. צמחי Petit הוואנה SR1 על אדמה, במקום זרעי טבק על הסירים מתאימים מלאים באדמת שתילה רגילה לנביטה. לאחר 2 שבועות, להעביר את השתילים לעציצים בודדים. דגירה צמחים בחממה עם קבוע 22 ° C (תקופה אפלה) או 25 ° C (תקופת אור) ו70% לחות אוויר יחסי. מספק תאורה ב16/8 שעה מחזור אור / חושך (למשל 400 מנורות W פיליפס IP65; 180 μmol · שניות -1 · מ -2; λ = 400-700 ננומטר) ומים בכל יום.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
TrCel5A וTrCel5A-mCherry באו לידי ביטוי בהצלחה בצמחי טבק באמצעות מערכת חולפת הביטוי (איורים 1 א ו 1 ב '). בחינה של דפוס הביטוי של חלבון היתוך TrCel5A-mCherry חשפה עלים בריאים (איור 1 ג), אשר הראה ביטוי חלבון נרחב תחת אור הירוק (1D איור).
מיצוי של החלבונים המסיסים בסך הכל בוצע בצמחי טבק שהיו עלים שהכילו הביע transiently חלבון TrCel5A ו- SDS הר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ביטוי רקומביננטי של cellulases הוא תחום עניין רב, בשל הרצון למערכות ייצור דלק ביולוגי יעילים יותר 1. צמחים מציעים אפשרויות רבות לייצור cellulase מוצלח, עם תכונות כגון טכניקות קצירה כלכלית ושיטות autohydrolysis להיות תכונות רצויות מאוד לייצור דלק ביולוגי בקנה מידה גדולה. יתר על כן, השימוש בגרסות מגוירים שונות לייצור חלבונים לאפשר, שינויים במידת צורך, posttranslational 20. שינוי צמחים כדי לאפשר ביטוי מכונן של cellulases, תוך שהיא מציעה יתרונות ברורים, היא שיטת .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי BMBF Forschungsinitiative "BioEnergie 2021 - Forschung für למות Nutzung פון Biomasse" והאשכול של אקסלנס "דלקים תפורים מביומסה", אשר ממומן באמצעות יוזמת המצוינות על ידי הממשלות פדרליות ואת המדינה הגרמנית לקידום מדע ומחקר באוניברסיטאות גרמנית.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside | SIGMA-ALDRICH | M6018 | |
| חומצה אצטית | ROTH | 3738 | |
| אצטוסירינגון (מרוכז) | ROTH | 6003 | |
| אנטיביוטיקה - קנמיצין | ROTH | T832 | |
| אנטיביוטיקה - ריפמפיצין | ROTH | 4163 | |
| אנטיביוטיקה - קרבניצילין | ROTH | 6344 | |
| נוגדן - ארנב אנטי His(6) pAb | ROCKLAND | 600-401-382 | |
| נוגדן - עז אנטי ארנב AP, FC pAb | DIANOVA | 111-055-008 | |
| אזו-קרבוקסימתיל צלולוז | MEGAZYME | S-ACMC | |
| β-ציקלודקסטרין | SIGMA-ALDRICH | C4805 | |
| סידן כלוריד דיהידרט | SIGMA-ALDRICH | C5080 | |
| Carboxymethyl cellulose | ROTH | 3333.1 | |
| צלולאז מTrichoderma reesei ATCC 26921 | SIGMA-ALDRICH | C2730 | |
| אדום קונגו | SIGMA-ALDRICH | 75768 | |
| Coomasie כחול מבריק G 250 | ROTH | 9598.2 | |
| D(+)-גלוקוז | ROTH | 8337 | |
| אתנול | ROTH | K928 | |
| נייר סינון - נייר ספיגה Rotilabo ROTH | CL67 | ||
| NBT/BCIP | SIGMA-ALDRICH | 72091 | |
| MES buffer | ROTH | 4256 | |
| מתנול | ROTH | 8388 | |
| נתרן ציטראט | ROTH | 3580 | |
| נתרן dodecylsulfate | SERVA | 20765 | |
| נתרן הידרוקסיד | ROTH | 6771 | |
| אדמה, Einheitserde קלאסי | ספקטרומטר PATZER GMBH | ||
| - אינפיניטי M200 | TECAN | ||
| סוכרוז | SIGMA-ALDRICH | S-5390 | |
| 4-הידרוקסי בנזהידרזיד | SIGMA-ALDRICH | H9882 | |
| תמיסת מלח חוצצת פוספט | ROTH | 1058 | |
| מקור אור UV - BLAK RAY | UVP | ||
| Vibratome - VT1000S | Leica |
מקורות
- Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms. Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).
- Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
