재조합 셀룰라아제 Cel5A의 표현에서<em&gt; 트리코더마 reesei</em&gt; 담배 식물에서

요약

담배 식물은 일시적 발현 시스템을 통해, 진균 셀룰라아제, TrCel5A을 제조 하였다. 발현은 형광 융합 단백질을 사용하여 모니터링 할 수 있고, 단백질 활성은 사후 발현 분석되었다.

초록

셀룰로오스 분해 효소, 셀룰라아제는 연구와 산업의 이익 모두 대상입니다. 그러한 균사 구축 진균류 및 혐기성 세균과 같은 어려운 배양 생물, 이러한 효소의 우세는,이 분야에서 재조합 기술의 사용을 재촉하고있다. 식물 발현 방법은 효소 및 기타 산업적으로 유용한 단백질의 대규모 생산을위한 바람직한 시스템이다. 여기서,는 담배 tabacum에서 곰팡이 endoglucanase, 트리코더마 reesei Cel5A의 일시적 발현을위한 방법이 설명되어 있습니다. 성공적인 단백질 발현은 mCherry 효소 융합 단백질을 사용하여 형광 모니터링 도시된다. 또한 기본적인 테스트 세트는 일시적 발현 T.의 활성을 조사하는 데 사용 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯, zymography뿐만 아니라 형광 염료 계 기질 분해 분석법 등 reesei Cel5A. 여기에 설명 된 시스템은 활성 세포를 생산하는 데 사용될 수있다짧은 시간주기에서 ulase, 구성 적 또는 유도 성 발현 시스템을 통해 식물에 추가 생산 잠재력을 평가하도록.

서론

리그 노 셀룰로오스 바이오 매스 액체 연료로의 전환의 저하는 화석 연료에 대한 의존도를 줄일 수있는 방법으로 구상하고있다. 경제성 매스 처리 시스템을 확립 한 가지 중요한 장애물은 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스 ^(1)의 효소 적 분해에있다. 식물 발현 시스템은 산업 규모에 효소의 생산을위한 큰 잠재력을 보여줍니다. 그들은 수천 년 동안왔다으로 수확 식물 경제적 볼륨에 농업 시스템이 이미 설치되어 있습니다. 식물에서 셀룰라아제의자가 가수 분해에 의한 생산은 ^2의 용이성 및 식물 세포벽 ^하나의 소화성을 증가시켜 하부 효소 수준의 사용을 최대화하기위한 전위와 같은 요인들에 바람직하다. 마지막으로, 식물 시스템은 식물 세포의 특정 영역에 대한 재조합 단백질의 타겟팅을 허용하고 ^세 posttranslationally ^필요한 효소를 수정할 수있다.

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된 담배 (담배)은 매우 일반적으로 인해 빠른 성장과 바이오 매스 축적 기능 ^4, 식물의 이종 단백질 발현 연구를위한 모델 생물로 사용됩니다. 재조합 단백질의 일시적 발현은 현지화으로 유연성을 유지하고, 따라서 선택된 단백질, 즉....

프로토콜

야생형 N.의 tabacum 식물 1. 성장

1. N. 성장 tabacum L. 이력서. 토양에 쁘띠 하바나 SR1 식물, 발아 일반 화분 용 흙으로 가득 적절한 냄비에 담배 씨앗을 배치합니다. 이주 후, 각각의 화분에 모종을 전송합니다. 상수 22 ° C (어두운 기간) 또는 25 ° C (빛 기간)과 온실에서 식물과 70 %의 상대 습도를 품어. 8분의 16 시간 빛 / 어둠주기에 조명을 제공합니다 (예 : 필립스 IP65 400 W 램프, 180 μmol · 초 ^-1 · m ^-2, λ = 400 ~ 700 nm의) 매일 물.

TrCel5A 및 TrCel5A - mCherry 단백질의 2. 일시적 발현

1. 멸균 조건에서 Agarobacterium 튜메 파시 엔스의 단일 콜로니 (GV3101 :: pMP90RK GMR, KMR, RifR) pTRAkc-ER-TrCel5A 또는 pTRAkc-ER-TrCel5A - mCherry 10 ㎖의 효모 추출물을 함유하는 삼각 플라스크로 전송 중 하나를 포함을 선택선택을위한 국물 (YEB, 제조업체의 사양에 따라 준비) 중간 및 카나마이신 (50 ㎎ / ㎖)....

결과

TrCel5A 및 TrCel5A-mCherry는 일시적 발현 시스템 (도 1a 및도 1b)를 사용하여 담배 식물에서 성공적으로 발현되었다. TrCel5A - mCherry 융합 단백질의 발현 패턴의 시험은 건강한 나뭇잎 녹색 빛 (그림 1D)에서 널리 단백질 발현을 보였다 (그림 1C)를 공개했다.

총 수용성 단백질의 추출이 포함 된 잎을 가지고 담배 공장에서 수행 된 일시적 TrCel5A 단백질을 발현하고 SDS-PAGE가 존재 (그림 2A, 레인 1)이었다 단백질의 큰 다양성을 보여 주었다. 식물 및 NTEPs 유래의 전체 가용성 단백질 샘플을 발현 TrCel5A에서 전체 가용성 단백질 샘플을, 55 ℃에서 10 분 동안 배양시켰다 다른 많은 (기본 담배) 단백질이이 온도에서 안정되지 동안 TrCel5A는 55 ° C에서 안정과 활성 상태로 유지됩니다........

토론

셀룰라아제의 재조합 발현으로 인해보다 효율적인 바이오 연료 생산 시스템 ^1에 대한 욕구에 큰 관심 분야입니다. 식물은 경제 수확 기술과 대규모 바이오 연료 생산을위한 매우 바람직한 특성 인자가 가수 분해 방법 등의 기능과 함께, 성공 셀룰라아제 생산을위한 많은 가능성을 제공합니다. 또한, 단백질을 제조하기위한 다른 언어 버전의 사용이 필요한 경우, 번역 후 변형 ^(20)에게 허용한다. 분명한 혜택을 제공하는 동시에, 셀룰라아제의 구성 적 표현을 가능하게하는 식물을 바꾸거나, 성공하지 않을 수도 있습니다 시간이 소요되는 방법입니다. 그러한 단백질 발현 유도 및 발현 메카니즘의 격리 같은 기술은 식물에서 성공적인 셀룰라아제 생산의 가능성을 증가하지만 이들은 여전히​​ 확립 수개월 간다. 여기서, 일시적 발현 방법은 특정 셀룰라아제의 가능성을 설명하기 위해 설명된다며칠 내에 공장 시스템을 통해 생산된다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside	SIGMA-ALDRICH	M6018
아세트산	ROTH	3738
아세토시링온(농축)	ROTH	6003
항생제 - 카나마이신	ROTH	T832
항생제 - 리팜피신	ROTH	4163
항생제 - 카르베니실린	ROTH	6344
항체 - rabbit anti His(6) pAb	ROCKLAND	600-401-382
항체 - goat anti rabbit AP, FC pAb	DIANOVA	111-055-008
Azo-carboxymethyl cellulose	MEGAZYME	S-ACMC
β-cyclodextrin	SIGMA-ALDRICH	C4805
Calcium chloride dihydrate	SIGMA-ALDRICH	C5080
카르복시메틸 셀룰로오스	ROTH	3333.1
Trichoderma reesei ATCC 26921	SIGMA-ALDRICH	C2730
콩고 레드	SIGMA-ALDRICH	75768
Coomasie brilliant blue G 250	ROTH	9598.2
D(+)-glucose	ROTH	8337
에탄올	ROTH	K928
여과지 - Rotilabo 압지	ROTH	CL67
NBT / BCIP	SIGMA-ALDRICH	72091
MES 버퍼	ROTH	4256
메탄올	ROTH	8388
구연산 나트륨	ROTH	3580
도데 실황산 나트륨	SERVA	20765
수산화나트륨	ROTH	6771
토양, 클래식 클래식	PATZER GMBH
분광계 - Infinite M200	TECAN
Sucrose	SIGMA-ALDRICH	S-5390
4-Hydroxy benzhydrazide	SIGMA-ALDRICH	H9882
인산염 완충 식염수	ROTH	1058
UV 광원 - BLAK RAY	UVP
진동 - VT1000S	Leica