Expresión recombinante de celulasa de Cel5A<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; En plantas de tabaco

Resumen

Las plantas de tabaco se usaron para producir una celulasa fúngica, TrCel5A, a través de un sistema de expresión transitorio. La expresión podría ser monitoreado usando una proteína de fusión fluorescente, y la actividad de la proteína se caracterizó después de la expresión.

Resumen

Enzimas degradantes de celulosa, celulasas, son objeto de la investigación y los intereses industriales. La preponderancia de estas enzimas en los organismos difíciles-a la cultura, como los hongos de fomento de hifas y bacterias anaerobias, ha acelerado el uso de tecnologías recombinantes en este campo. Métodos de expresión vegetales son un sistema conveniente para la producción a gran escala de enzimas y otras proteínas industrialmente útiles. En la presente memoria, se demuestran los métodos para la expresión transitoria de una endoglucanasa fúngica, Trichoderma reesei Cel5A, en Nicotiana tabacum. El éxito de expresión de la proteína se muestra, supervisado por fluorescencia utilizando una proteína de fusión mCherry-enzima. Además, una serie de pruebas básicas se utilizan para examinar la actividad de T. transitoriamente expresó reesei Cel5A, incluyendo SDS-PAGE, transferencia Western, zimografía, así como la fluorescencia y ensayos de degradación del sustrato con base de tinte. El sistema aquí descrito se puede utilizar para producir una célula activaULASE en un corto período de tiempo, a fin de evaluar el potencial de la producción en plantas a través de sistemas de expresión constitutivos o inducibles.

Introducción

La degradación de la biomasa lignocelulósica y su conversión en combustible líquido ha sido concebido como un método para reducir la dependencia de los combustibles fósiles. Un obstáculo importante en el establecimiento de sistemas de procesamiento de biomasa económicamente viables es en la degradación enzimática de la celulosa y la hemicelulosa ^1. Sistemas de expresión de la planta muestran un gran potencial para la producción de enzimas a escala industrial. Los sistemas agrícolas a las plantas de cosecha económica y en el volumen ya están establecidos, como lo han sido durante miles de años. La producción de celulasas en las plantas es deseable deb....

Protocolo

1. Crecimiento de tipo salvaje de N. tabacum plantas

1. Para crecer N. tabacum L. cv. Plantas Petit Havana SR1 en suelo, coloque las semillas de tabaco en macetas llenas de tierra apropiadas para macetas normales para la germinación. Después de 2 semanas, la transferencia de las plantas de semillero a macetas individuales. Incubar las plantas en un invernadero con constante de 22 ° C (periodo de oscuridad) o 25 ° C (punto de luz) y 70% de humedad relativa del aire. Proporcionar iluminación en un 16/8 horas de luz / oscuridad ciclo (por ejemplo, Philips IP65 400 W lámparas; 180 mmol · ^s-1 · ^m-2; λ = 400-700 nm) ....

Resultados

TrCel5A y TrCel5A-mCherry se expresaron con éxito en plantas de tabaco usando el sistema de expresión transitoria (Figuras 1A y 1B). El examen del patrón de expresión de la proteína de fusión TrCel5A-mCherry reveló hojas sanas (Figura 1C), que mostró que la expresión de proteínas generalizada con luz verde (Figura 1D).

La extracción de las proteínas solubles totales se realizó en plantas de tabaco que tenían hojas que conten.......

Discusión

La expresión recombinante de celulasas es un campo de gran interés, debido al deseo de los sistemas de producción de biocombustibles más eficientes ^1. Las plantas ofrecen muchas posibilidades para la producción de celulasas éxito, con características tales como las técnicas de aprovechamiento económico y métodos autohidrólisis son propiedades muy deseables para la producción de biocombustibles a gran escala. Además, el uso de diferentes localizaciones para la producción de proteínas permite, en caso necesario.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
4-metilumbeliferil β-D-celobiósido	SIGMA-ALDRICH	M6018
Ácido acético	ROTH	3738
Acetosiringón (concentrado)	ROTH	6003
Antibiótico - kanamicina	ROTH	T832
Antibiótico - rifampicina	ROTH	4163
Antibiótico - carbenicilina	ROTH	6344
Anticuerpo - conejo anti His(6) pAb	ROCKLAND	600-401-382
Anticuerpo - cabra anti conejo AP, FC pAb	DIANOVA	111-055-008
Azo-carboximetilcelulosa	MEGAZYME	S-ACMC
β-ciclodextrina	SIGMA-ALDRICH	C4805
Cloruro de calcio dihidratado	SIGMA-ALDRICH	C5080
Carboximetilcelulosa	ROTH	3333.1
Celulasa de Trichoderma reesei ATCC 26921	SIGMA-ALDRICH	C2730
Congo rojo	SIGMA-ALDRICH	75768
Coomasie azul brillante G 250	ROTH	9598.2
D(+)-glucosa	ROTH	8337
Etanol	ROTH	K928
Papel de filtro - Rotilabo papel secante	ROTH	CL67
NBT/BCIP	SIGMA-ALDRICH	72091
TAMPÓN MES	ROTH	4256
Metanol	ROTH	8388
Citrato de sodio	ROTH	3580
Dodecililsulfato de sodio	SERVA	20765
Hidróxido de sodio	ROTH	6771
Suelo, Einheitserde classic	Espectrómetro PATZER GMBH
- Infinite M200	TECAN
Sacarosa	SIGMA-ALDRICH	S-5390
4-hidroxibenzhidrazida	SIGMA-ALDRICH	H9882
ROTH	1058		tamponada con fosfato
- BLAK RAY	UVP
Vibratome - VT1000S	Leica

Fuente de luz ultravioleta