Tütün bitkileri, bir geçici ekspresyon sistemi ile, bir fungal selülaz, TrCel5A üretmek için kullanıldı. Ekspresyon, bir floresan füzyon proteini kullanılarak takip edilebilir, ve protein aktivitesi post-ekspresyon karakterize edilmiştir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Rekombinant Cellulase Cel5A İfade itibaren
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Selüloz alçaltıcı enzimler arasında, selülazlar, araştırma ve hem de sanayi ilgi hedeflerdir. Bu tür hifler-yapı mantar ve anaerobik bakteriler gibi zor-organizmaların kültür, bu enzimlerin üstünlüğü, bu alanda yeniden birleştirici teknolojilerin kullanımı hızlandırdı. Bitki ifade yöntemleri enzimler ve diğer endüstriyel olarak kullanışlı proteinlerin büyük ölçekli üretimi için arzu edilen bir sistemi vardır. Burada, Nicotiana tabacum bir mantar endoglukanazın, Trichoderma reesei Cel5A arasında geçici ekspresyonu için yöntemler gösterilmektedir. Başarılı bir protein sentezleme mCherry-enzim füzyon proteini kullanılarak floresan ile gözlenmiş gösterilmiştir. Buna ek olarak, temel testler bir dizi geçici ifade T. aktivitesini incelemek için kullanılır SDS-PAGE, Western blotting, zimografi, hem de ve floresan boya bazlı alt-tabaka bozulması deneyleri de dahil olmak üzere reesei Cel5A. Burada anlatılan sistem etkin bir hücre üretmek için kullanılabilirKısa bir süre içinde ulase, kurucu ya da uyarılabilir sentezleme sistemleri ile bitkilerde daha fazla üretim potansiyelini değerlendirmek üzere.
Giriş
Lignoselülozik biyokütle ve sıvı yakıt dönüştürülmesine Bozulması fosil yakıtlara bağımlılığı azaltmak için bir yöntem olarak tasavvur edilmiştir. Ekonomik açıdan biyokütle işleme sistemleri kurulmasında önemli bir engel selüloz ve hemiselüloz 1 enzimatik bozunma bulunmaktadır. Bitki ekspresyon sistemleri, bir endüstriyel ölçekte enzimlerin üretimi için büyük bir potansiyel göstermektedir. Onlar binlerce yıldır olduğu gibi hasat bitkilerin ekonomik ve hacim için Tarımsal sistemler zaten kurulmuş. Bitkilerdeki selülaz üretimi nedeniyle autohydrolysis 2'nin kolaylığı ve bitki hücre duvarlarının 1 sindirilebilirliğini arttırara....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Vahşi tipli N. tabacum Bitkiler 1. Büyüme
- N. büyümek tabacum'un L. cv. Toprak Petit Havana SR1 bitkiler, çimlenme için, normal saksı toprağı ile doldurulmuş uygun saksılara tütün tohumları yerleştirin. 2 hafta sonra, ayrı saksılara fidan aktarın. Sabit 22 ° C (karanlık dönemi) ya da 25 ° C (ışık periyodu) ile bir sera içinde bitkiler ve% 70 nispi hava nemi inkübe edin. 16/8 saat aydınlık / karanlık döngüsü aydınlatma sağlamak (örneğin Philips IP65 400 W lamba, 180 ľmol · sn -1 · m -2; λ = 400-700 nm) günlük ve su.
TrCel5A ve TrCel5A mCherry Proteinlerin 2. Geçici....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
TrCel5A ve TrCel5A mCherry geçici ekspresyon sistemi (Şekil 1A ve 1B) kullanılarak başarılı bir şekilde tütün bitkilerinde ifade edildi. TrCel5A mCherry füzyon proteininin ifade deseninin incelenmesi sağlıklı yaprakları yeşil ışık (Şekil 1D) altında yaygın bir protein ekspresyonu gösterdi (Şekil 1 C) ortaya çıkardı.
Toplam çözünür proteinlerin çıkarımı ihtiva yaprağı vardı tütün bitkileri üzerinde gerçekleştirilmiştir geçici.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Selülazlann Rekombinant ifadesi nedeniyle daha verimli biyoyakıt üretim sistemleri 1 için arzu, büyük ilgi alanıdır. Bitkiler, ekonomik hasat teknikleri ve büyük ölçekli biyoyakıt üretimi için çok cazip özellikleri olan autohydrolysis yöntemleri gibi özellikleri ile başarılı selülaz üretimi için pek çok olanak sunuyor. Ayrıca, proteinlerin üretilmesi için farklı lokalizasyonu kullanımı, gerekirse, translasyon sonrası modifikasyonlar 20 izin verir. Belirgin avantajlar sunarken, selülazlar esas ifade.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Bu çalışma Bmbf Forschungsinitiative tarafından desteklenen "BioEnergie 2021 - Forschung für nutzung von BIOMASSE ölmek" ve bilimi teşvik etmek için Alman federal ve eyalet hükümetleri tarafından Mükemmellik Girişimi aracılığıyla finanse edilmektedir Mükemmellik "Biyokütle den Tailor-made Yakıtlar", bir küme ve Alman üniversitelerinde araştırma.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 4-metilumbelliferil ve beta;-D-selyobiyosid | SIGMA-ALDRICH | M6018 | |
| Asetik asit | ROTH | 3738 | |
| Asetosyringon (konsantre) | ROTH | 6003 | |
| Antibiyotik - kanamisin | ROTH | T832 | |
| Antibiyotik - rifampisin | ROTH | 4163 | |
| Antibiyotik - karbenisilin | ROTH | 6344 | |
| Antikor - tavşan anti His(6) pAb | ROCKLAND | 600-401-382 | |
| Antikor - keçi anti tavşan AP, FC pAb | DIANOVA | 111-055-008 | |
| Azo-karboksimetil selüloz | MEGAZYME | S-ACMC | |
| β-siklodekstrin | SIGMA-ALDRICH | C4805 | |
| Kalsiyum klorür dihidrat | SIGMA-ALDRICH | C5080 | |
| Karboksimetil selüloz | ROTH | 3333.1 | |
| Trichoderma reesei ATCC 26921 | SIGMA-ALDRICH | C2730 | |
| Kongo kırmızısı | SIGMA-ALDRICH | 75768 | |
| Coomasie parlak mavi G 250 | ROTH | 9598.2 | |
| D (+) - glikoz | ROTH | 8337 | |
| Etanol | ROTH | K928 | |
| Filtre kağıdı - Rotilabo kurutma kağıdı | ROTH | CL67 | |
| NBT/BCIP | SIGMA-ALDRICH | 72091 | |
| MES tamponu | ROTH | 4256 | |
| Metanol | ROTH | 8388 | |
| Sodyum sitrat | ROTH | 3580 | |
| Sodyum dodesilsülfat | SERVA | 20765 | |
| Sodyum hidroksit | ROTH | 6771 | |
| Toprak, Einheitserde classic | PATZER GMBH | ||
| Spektrometresi - Sonsuz M200 | TECAN | ||
| Sükroz | SIGMA-ALDRICH | S-5390 | |
| 4-Hidroksi benzhidrazid | SIGMA-ALDRICH | H9882 | |
| Fosfat tamponlu tuzlu | su ROTH | 1058 | |
| UV ışık kaynağı - BLAK RAY | UVP | ||
| Vibratom - VT1000S | Leica |
Kaynaklar
- Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms. Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).
- Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
