Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Простой Поведенческая Анализ для тестирования зрительной функции в Published: June 12, 2014 doi: 10.3791/51726
Automatic Translation
1, 1
1Ophthalmology Department, Center for Vision Research, SUNY Eye Institute, Upstate Medical University

Summary

Xenopus Laevis головастики предпочитают плавание на белом стороне черного / белого танка. Такое поведение руководствуется своим видением. На основе этого поведения, мы представляем простой анализ, чтобы проверить зрительные функции головастиков.

Abstract

Измерение зрительной функции в головастиков лягушки, Xenopus Laevis, позволяет скрининг для слепоты в живых животных. Оптокинетическим ответ видение основе, рефлексивно поведение, которое наблюдается у всех позвоночных протестированных. Головастик глаза маленькие, поэтому реакция хвост флип был использован в качестве альтернативной меры, которая требует квалифицированный специалист для записи тонкий ответ. Мы разработали альтернативный поведение анализа основан на том, что головастиков предпочитают, чтобы плавать на белом стороне бака при помещении в резервуар с обоих черных и белых сторон. Анализ, представленный здесь является недорогим, простым альтернатива, которая создает ответ, который легко измерить. Установка состоит из штатива, веб-камера и вложенных танков тестирования, доступной в большинстве Xenopus лабораторий. Эта статья включает в себя фильм, показывающий поведение головастиков, до и после разрыва зрительный нерв. Для того чтобы проверить функцию одним глазом, мы также включаем предтель результаты головастика, в которой каждый глаз прошли сетчатки аксотомии на последовательных дней. Будущие исследования могут разработать автоматизированную версию этого анализа для тестирования видение многих головастиков сразу.

Introduction

Xenopus Laevis были использованы в качестве модельного организма для изучения формирования глаз. Глаза быстро развиваться, растет до погашения менее чем за неделю тестирования генов или путей, которые оказывают влияние на визуальной разработки и функции. Чтобы проверить зрительные функции, оптокинетическим и оптомоторная ответ был использован у рыбок данио и Xenopus головастиков соответственно 1,2. Потому что глаза Xenopus головастиков относительно меньше, чем у рыбок данио, этот анализ требует использования специального оборудования и подготовленного персонала для выявления тонкий хвост-флип и глаз-движения поведение в Xenopus. Более надежная поведение в Xenopus является предпочтение для купания в резервуаре с белым фоном, который описан здесь 3. При размещении головастика в полтора черный / наполовину белый танк, предварительно метаморфических головастик быстро плывет к белой стороне резервуара. Ранее мы использовали эту пробу, чтобы определить, плюрипотентных клеток, полученныхГлаза были функциональны 4. Здесь мы приводим подробное версию этого анализа, который может быть использован для тестирования зрительной функции premetamorphic головастиков Xenopus.

Этот анализ является более простым, чем анализа отклика оптомоторная, так как он только требует установленный цифровую видеокамеру, цифровой программное обеспечение камеры и стандартного оборудования можно найти в большинстве Xenopus лабораторий. Кроме того, записанный ответ не требует специальной подготовки к результатам учетные. Наши представительства результаты показывают, что та же группа головастиков, претерпев двойной сетчатки аксотомии, плавать случайно вокруг танка. Мы также включили результаты поведение анализа из репрезентативной головастика, показывая, как один глаз может быть проверена для визуального ответ. Лист был включен так, что числа, полученные в ходе анализа могут быть вставлены и проанализированы. Этот лист может быть использован для определения головастиков испытаны, имеют ли визуальный отклик.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Уход животных

Xenopus Laevis головастики используемые в этом исследовании были выращены, поднял и лечение в соответствии с процедурами, утвержденными северной части штата медицинского университета IACUC и Руководства по проблемам помощи и использованию лабораторных животных.

. 1 Настройка Предварительно поведение: Головастики

  1. Получение оплодотворенные эмбрионы Xenopus из коммерчески доступного источника или в пробирке оплодотворению ооцитов, как описано выше 6.
  2. Наведите бластула в нейронных эмбрионов на стадии пластины на 18 ˚ С в 60 мм чашки Петри, содержащие 0.1x MMR [10 изменения решение (MMR) акции Рингера X Marc автора (10 мМ MgCl 2, 20 мМ KCl, 20 мМ CaCl 2, 50 мМ HEPES; 1 М NaCl; доводят до рН 7,5, в автоклаве и хранили при комнатной температуре)] с 50 мкг / мл гентамицина антибиотика. Изменение 0.1x MMR каждый день, и удалить все мертвые эмбрионы.
  3. Как только эмбрионы достигают Nieuwkoop и Faber этап ~ 27 - 30 7, переключения тыс.е эмбрионов в 0,1 X MMR без антибиотика, чтобы позволить кишечника бактериального роста.
  4. Расти головастиков, пока они не достигнут стадии подачи (этап 45) и переместить их в 100 мм чашки Петри, наполненных 0,1 X MMR. Накормите их крапивы порошок супернатант через день в течение недели, меняя 0.1x MMR на прошедший день.
  5. После одной недели в 100 мм чашки Петри, перейти животных половиной галлонов цистерны, заполненные лягушки воды [0,5 г / л мгновенный океан и 2 мМ фосфат натрия двузамещенный (Na 2 HPO 4: MW 141,96) рН 6,8]. Накормите их как на этапе 2.4, но менять воду всего 2-3 раза в неделю, когда вода мутная. Поддерживать животных в 12-часовом light/12 темно светового цикла с огни включения в 6 утра.
  6. Поместите половину-литровый аквариум с испытуемых на белой поверхности, как лаборатории скамейке underpad, по крайней мере, 12 часов O / N, перед тестированием.
  7. Тестовые головастики на этапах 45 до 50, как описано в шаге 3 ниже.

. 2 Установка Предварительно поведение: Equipmenт

  1. Отложите площадь лаборатории для поведения анализа. Он должен быть в тихом, с низким уровнем трафика области со стандартным люминесцентным освещением.
  2. Подготовка к тестированию танки для животных.
    Вложенный, наполовину галлон тестирования танки состоят из двух частей: внутренний бак, который будет содержать воду и головастиков; и внешний бак с визуального стимула.
    1. Для внутреннего резервуара, сделать небольшой след в наружных углах с шулером, 5 см от дна; это линия воды (рис. 1А, зеленая пунктирная линия).
    2. Кроме того, для внутреннего резервуара, заполнить divets в баке (в углах и центре) с инертным соединением, как Sylgard эластомера. Примечание: головастики будут задерживаться в этих областях, если они не заполнены дюйма
    3. Для внешнего резервуара, накрыть ровно половина от внешней одном баке с черной изоленты, а другая половина с белым ткани бумаги рисунке 1b.
  3. Поместите танки напрививки проигрыватель.
  4. Настройка веб-камеры / штатив так, чтобы она выше тестирования танков. Настройка камеры, чтобы позволить визуализацию области тестирования, как показано на рисунке 1С.
  5. Подключите веб-камеру к компьютеру с программным обеспечением Quicktime Player установлен 5. Включите камеру. В QuickTime Player, в Файл выберите 'нового фильма запись.' Установка анализ поведения будут видны на компьютере сразу.
  6. Драпируйте легкий хлопчатобумажную ткань по всей установки, чтобы уменьшить внешние сигналы, которые могут повлиять на поведение головастика, а также, уменьшить отражение света от поверхности воды.
  7. Убедитесь, что яркость под ткань мер между 35-50 кд / м 2.

3. Поведение Анализ

  1. Заполните внутреннюю тестирования бак до отметки 5 см воды сделали в шаге 1.2.1 с лягушки воды.
  2. С помощью небольшой сети, осторожно двигаться животное во внутренний резервуар тестирования.
  3. Открыть QuickTime программное обеспечение на компьютере и, используя внешний резервуар в качестве руководства, чтобы убедиться, что камера находится в состоянии представить себе и записать область тестирования.
  4. Напишите имя животного, дату и время на листке бумаги и записи с камеры.
  5. Поместите тест-танк во внешний бак с черной стороне бака в правом рисунке 2.
  6. Начните немедленно записи фильма устроив бак и установить таймер на 2 мин.
  7. Когда таймер подает звуковой сигнал, снимите внутреннюю тест танк, поверните наружный резервуар на 180 ° и установите внутреннюю тест бак внутри внешнего резервуара. Запустите таймер. Примечание: теперь черная сторона должна быть на другой стороне.
  8. Повторите шаг 3.7, еще восемь раз в общей сложности десять испытаний. Используйте рисунок 2 в качестве ориентира, помечая каждый суда.
  9. Повторите поведения анализа в два отдельных дня.

4. Сетчатки аксотомии

  1. Поместите животное в 0,02% Tricaine, пока они не отвечать на запросыв хвостовой крайнем случае с # 3 щипцами.
  2. Растопить 1% агарозы в 0,1 X MMR, а затем добавить к 60 мм чашки Петри. После охлаждения сделать небольшое прямоугольное дерн в агарозе и добавить головастика в дерн с небольшим 0,02% Tricaine, так что животное частично погруженным в жидкость.
  3. Прокалывают кожу под углом 45 градусов за дорсальную область глаза с иглой 25 г, в то время как крепление животное от щипцов на противоположной стороне.
  4. Стараясь не отрезать вену, которая лежит рядом с зрительного нерва, тщательно достичь в отверстие с # 5 щипцами, СНиП зрительный нерв и перевернуть его с пути. Если есть сильное кровотечение из-за случайно отрезая артерию, а затем быстро разместить животное в 2% Tricaine усыпить. ВНИМАНИЕ: 2% раствор Tricaine может вызвать онемение в организме человека. Это решение должно быть в перчатках.
  5. Для восстановления животного после операции, поместить животное в 100 мм чашки Петри с 0.7x MMR и 50 мкг / мл гентамицина в течение 20 мин. Небраскахи, передача головастик, чтобы бака утилизации лягушки воды. Пусть животное сидение O / N.
  6. На следующее утро, проверить зрительные функции, как описано выше (шаги 3,1-3,9).

5. Анализ результатов

  1. После испытания окончании измерения количества времени головастика остается на черной стороне бака.
    1. Вручную просмотра видео с помощью программного обеспечения, который отображает время и позволяет частое приостановку. Посмотрите на время отображения видео. Записывают начало двух проб мин, что, когда внутренний бак успешно гнезда внутри внешнего резервуара и в квадрат в поле зрения камеры.
    2. Используйте позицию глазах головастик, чтобы определить, с какой стороны бака животные плавают на. Определить пересекая с одной стороны резервуара в другой, только когда оба глаза пересекли черный / белый линию.
  2. Запишите начало и конец каждого интервала (в секундах), что животное тратит на черной стороне. Пауза и повторноветер видео для обеспечения точности. Всего в сек в каждом испытании.
  3. Входной эти цифры в прилагаемом поведения листе. Лист будет вычислять соотношение количества времени, что животное, потраченные на белой стороне путем вычитания времени, затрачиваемого на черной стороне резервуара от общего 120 сек проб и разделите на общее время в сек [(120 - всего секунд тратится на черная сторона) / 120 сек]. Средние листа это соотношение по всем 10 испытаний.
  4. Используйте Т-тест студента, в паре, двустороннее распределение, чтобы определить, испытания между дней значимы (р ≤ 0,05).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Предыдущие доклады показали, что premetamorphic головастики Xenopus предпочитают плавать на белом стороне черного / белого танка и называется этот анализ, цвет фона Preference Пробирной 3 мы изменили этот анализ для того, чтобы проверить зрительные функции либо глаза головастиков в менее чем за неделю. Таким образом, их глаза могут быть собраны для гистологического исследования.

Здесь мы показываем, как реакция обусловлена ​​визуальные подсказки. В Movie 1, головастики в левой и правой панелях те же животные. Слева находятся животные до операции и справа, животные после разрыва оба зрительных нервов. Мы кружились воду, чтобы показать, что ничего не добавляется к отражению животных от черной стороне или привлечь их к белой стороне. В фильме, мы предоставляем схему головастиков в нижних углах, который показывает состояние зрительного нерва для каждого набора животных. В Movie 1, нормального, ин-управляемые головастики реагировать на цвет фона менее чем за 30 сек в испытательном резервуаре в то время как слепые головастики плавают бесцельно вокруг танка. Скорость кино была увеличена и записал фактическое время в правом верхнем углу.

Чтобы проверить зрение на один глаз, мы включили результаты из животного, чей зрительный нерв был разорван на один глаз и испытания в нашей анализе. Зрительный нерв в другой глаз был разорван после двух дней тестирования, а поведение видение наведением снова протестирован на следующих дней. На фиг.3 представлен график показывает количество времени головастика выбрал плавать на черном стороне бака. Это была измерена на шести последовательных дней фигуре 3А. Как описано выше, право зрительного нерва были разорваны после поведение был протестирован на 2-й день и влево, после теста на поведение на 4-й день. Головастика предпочтительным белую сторону резервуара случайным образом на 50% от времени фиг.3С. Обратите внимание, чтоIMAL провел больше времени на белом стороны резервуара в течение последних 6 испытаний в дни с 1 по 4. количество времени, потраченного на черной стороне было больше даже в дни, 5 и 6, когда животное был слеп на оба глаза. Результаты каждого из этих двух дней были усреднены вместе и представлены в виде графиков фиг.3С.

Рисунок 1
Рисунок 1. Экспериментальная установка из видения наведением поведения анализа. (А) Внутренний тест-танк остается прозрачным и маркировку, указывающую уровень воды (зеленый пунктир на углу). (В) Внешняя тест-танк покрыт черным изолента на одной половине и белый папиросной бумаги, с другой. (С) Головастики визуализируются с помощью веб-камера помещается на штатив и подключенный к портативному компьютеру. Тестирование бакас остальной на прививки поворотного стола, что обеспечивает удобство поворота между испытаниями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Схема, как выполняется видение наведением поведение анализ. Прямоугольники представляют тестовый танк, показывая, как наполовину белый / половиной изменения черная область с каждого испытания. Это может быть использовано во время поведения анализа по случаю тройственное число. Тест бак по праву является крупным планом головастика и его ожидаемого поведения в течение двух мин анализе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

хин-страница = "всегда"> Рисунок 3
Рисунок 3. Репрезентативного эксперимента подсчета процент времени головастика плавали на белом стороне испытательного резервуара. (A) Размер сек головастика потрачены на черной стороне бака измеряется и помещены в таблицу. (B ) таблицу в превращается в процентах от времени, проведенного белой стороне бака. Это делается путем вычитания сек, потраченные на черной стороне от общего времени попыток (120 сек) и деления на 120 сек. Головастики, которые были лечить (U), было ни одного аксотомии (SA), а затем дважды аксотомии (DA) были испытаны. (С) график представляет средний процент времени, проведенного в белой стороне (белый бар) и черной стороной ( Черная полоса). В таблице используется, чтобы сделать график показан ниже.g3highres.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Фильм 1. Поведенческая реакция зрячих и слепых животных в белом фоне привилегированную анализа. Головастиков в левой и правой панелях одинаковы, но те, о праве прошли двойную сетчатки аксотомии. Схематическое в нижних углах, указывает ли зрительный нерв не поврежден или разорваны (синяя полоса). Таймер в верхнем правом углу указывает время. Фильм ускоряется для более удобного просмотра. После того, как в белой области, обратите внимание, как головастики плавать близко к границе между белым и черным, и в обратном направлении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео.

<TD> 1,00 высота: 21px; "> побед 6
Дау 1 День 2 День 3 День 4 День 5 День 6
Судебная 1 0 0 0 0 0 0
Судебная 2 0 0 0 0 0 0
Судебная 3 0 0 0 0 0 0
Судебная 4 0 0 0 0 0 0
Судебная 5 0 0 0 0 0 </ TD> 0
Судебная 6 0 0 0 0 0 0
Судебная 7 0 0 0 0 0 0
Судебная 8 0 0 0 0 0 0
Судебная 9 0 0 0 0 0 0
Судебная 10 0 0 0 0 0 0
Соотношение времени, потраченного на белой стороне
Соотношение 1 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
Соотношение 2 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
Соотношение 3 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
Соотношение 4 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
Соотношение 5 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
Соотношение 6 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
Соотношение 7 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
Соотношение 8 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
Соотношение 9 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
Соотношение 10 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
Средний 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
День 1 День 2 День 3 День 4 День 5 День 6
Судебная 1 0 0 0 0 69 69
Судебная 2 0 3 0 88 68 58
Судебная 3 7 0 28 0 58 47
Судебная 4 0 0 11 0 59 72
Судебная 5 0 0 7 22 57 57
Судебная 6 1 98 4 56 69 53
Судебная 7 0 13 33 24 44 57
Судебная 8 0 113 38 24 36 64
Судебная 9 0 0 4 43 60 57
Судебная 10 1 21 0 32 63 80
Соотношение времени, потраченного на белой стороне >
Соотношение 1 100% 100% 100% 100% 43% 43%
Соотношение 2 100% 98% 100% 27% 43% 52%
Соотношение 3 94% 100% 77% 100% 52% 61%
Соотношение 4 100% 100% 91% 100% 51% 40%
Соотношение 5 100% 100% 94% 82% 53% 53%
99% 18% 97% 53% 43% 56%
Соотношение 7 100% 89% 73% 80% 63% 53%
Соотношение 8 100% 6% 68% 80% 70% 47%
Соотношение 9 100% 100% 97% 64% 50% 53%
Соотношение 10 99% 83% 100% 73% 48% 33%
Средний 99% 79% 90% 76% 51% 49%

Рабочий лист 1. Белый фон предпочтение лист анализа. Этот лист имеет расчеты, построенные в так что его можно использовать для ввода цифр и подводит итоги.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы сообщаем здесь простой видение наведением поведенческий анализ, который может быть легко выполнена в рамках недели по минимально подготовленных персонала лаборатории. В то время как другие анализы требуют специального оборудования и опыта в поведении животных, этот анализ позволяет быстрый тест для определения зрительной функции. Другой поведенческая анализ, Визуальный Избежание анализа, был разработан, чтобы определить, каким образом Tectum способствует зрительного восприятия в Xenopus 10. Это анализе измеряют пространственное настройка и контрастная чувствительность в ответ на перемещение против стабильной фоне, и, таким образом, можно измерить более специализированное поведение видения на основе, чем простое анализа сообщили здесь. Автоматизированная система поведение было сообщено, что можно измерить количество времени, потраченного на одной стороне резервуара 8. Существует также коммерчески доступное программное обеспечение (например, программное обеспечение ЛЮБОЙ-лабиринт), который был использован, чтобы измерить количество времени рыбок данио потратить в темных или ярких условиях 9.Дни рождения Ssay мы сообщаем здесь не требует приобретения этих видов дорогостоящего оборудования или программного обеспечения, но вместо этого полагается на повседневных реагентов и оборудования для измерения зрительную функцию.

Видение наведением анализ проводят на одного животного, чтобы проверить его зрительную функцию. При сравнении результатов анализа поведения нескольких головастиков друг с другом, мы не наблюдали статистическое различие между животными в группах лечения. Мы протестировали три головастиков на шести дней подряд, а также испытания еще пять животных на три дня подряд, работает десять испытания в день. В любом случае, мы не обнаружили статистически значимых изменений среди необработанных или отдельных групп аксотомии (р = 0,2067), все же получены статистически значимые изменения, когда эти животные были по сравнению с двойной группы аксотомии (р = 0,002). Это была измерена с помощью 6.0c программного обеспечения Prism работает 2-полосная ANOVA статистический тест с несколькими сравнительного теста Тьюки (N = 8 головастиков). Чтобы иметь максимальнуюколичество точек данных до операции, мы рекомендуем использовать шестидневный поведения анализа. Если результаты должны быть получены быстрее с меньшим дегенерации ткани, мы предлагаем с помощью трехдневный систему.

Этот анализ тестов одно животное за один раз. Мы провели экспериментальные исследования, чтобы увидеть, если два головастики или более могут быть измерены одновременно. Чтобы определить, с двумя головастиков в одном резервуаре влияет на их предпочтение белой стороне резервуара, мы протестировали каждый головастика отдельно, а затем вместе. Так как снимки были сделаны над баком, если головастики плавали выше или ниже друг друга в течение длительного времени, мы обнаружили, что трудно отличить друг от друга. Если бы мы использовали головастиков различных размеров, мы обнаружили, что чем больше можно было бы повлиять, где поменьше плавал. Будущие технологии могут быть разработаны, чтобы генетически марки головастиков, которые позволили бы лучше отслеживать нескольких животных одного и того же размера.

При выполнении этого теста на десятках tadpoле, мы заметили, что некоторые головастики предпочитали белую сторону более последовательно, чем другие. Головастики, поведение которых варьируется более чем на 10% в течение двух последовательных дней, мы взяли бы снова протестирован на третий день до операции. Возможно, это было из-за другого наблюдения: мы заметили, что размещение животных на белом фоне также сделал разницу в их предпочтительности для белой стороне бака. Имея, что дополнительный день, возможно, помогли состояние некоторых головастиков, предпочитают белую сторону танка. Ограничение этого анализа является то, что он только проверяет зрительную функцию. Изменчивость мы наблюдали может быть связано с другими пороками развития, помимо снижения зрительной функции или слепота. По этой причине животные, которые показали менее 60% предпочтение перед операцией не были проверены дальше.

Мы также протестировали ряд возрасте от предварительно метаморфических головастиков. Мы обнаружили, что головастики моложе этапе 45 были очень маленькими, и их глаза были трудно отследить с помощью нашего мыBCAM. Старые головастики (стадии 51 - 55 +) были более отвлекаться; хотя они, в конечном счете провели больше времени на белом стороне резервуара, они, кажется, занимает больше времени, чтобы плавать там. Эти старые животные были больше, и поэтому легче отслеживать, но необходимо тестирование до операции, как указано выше. В отличие от этого, большинство головастиков на стадии 45 до 50 вели себя, как ожидалось, и животные этих возрастов бы лучше, чтобы использовать в будущих исследованиях.

Суточный изменения света было показано, влияет на зрение наведением поведенческие реакции в Xenopus 2. В соответствии с этим наблюдением, мы заметили, что то же самое животное, которое быстро поплыл к белой стороне испытательного резервуара в испытаниях, проведенных в первой половине дня, длится намного дольше во второй половине дня тестов поведения. После проведения ряда "же животных / различными временными" испытаний, мы определили лучшее время для поведения анализа было с 6 утра до 1 дня.

Мы также использовали цифровую handhполем видеокамеры, подключенной по FireWire для проверки животных в условиях низкой освещенности 5. Это позволило тестирование ночного или ночное зрение, в которой животное использует свои стержень фоторецепторов видеть. Условия были изменены просто найти наименьшее количество света, необходимого для животного, чтобы выполнить видение наведением анализа. Анализ, представленный здесь тесты дневного зрения, в которой животное в основном использует свои конус фоторецепторов видеть. Комбинируя эти подходы, оба типа видения, скотопического и фотопических, могут быть проверены.

Мы использовали эту пробу для тестирования зрительной функции животных с внематочной глаза, выращенных из плюрипотентных клеток сверхэкспрессирующими внутренне выраженные факторы глаз поле транскрипции и внешнюю фактор, Noggin. Глаза, полученные от этих тканей были функциональными 4,11. Ноггин также играет определенную роль в передней развития центральной нервной системы 12, но с помощью этого видения наведением анализа в сочетании с животных крышки трansplant анализ, его роль в развитии глаз был раскрыт. Другие внешние факторы, которые влияют на формирование раннего эмбриона, но еще не было показано, что роль в развитии глаза могут индуцированной образование сетчатки предшественников в плюрипотентных животных капитализации клеток 4,11. Используя эту поведенческую анализа, будущие исследования могут определить зрительные функции этих вновь созданные глазами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Эта работа финансировалась за счет грантов от Национального института здравоохранения: EY015748, EY017964 (МЭЗ), и EY019517 (АСВ). Эта работа также была поддержана исследований в области профилактики слепоты неограниченный грант на офтальмологического отделения и Львов Центральной Нью-Йорке. Мы также хотели бы поблагодарить нашего зоотехник, Мэтью Mellini, за его отличную уход за животными и вмешалась в главную роль в этом видео.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/2 Gallon Flex-Tank with Cover eNasco SB19271M Size: 5-3/8" x 7" x 3-3/4"
Black electrical tape
White tissue paper
Large inoculating turntable VWR 50809-022 Size: Dia 114.3 x  H 76.2 mm (4 1/2  x  3")
Durasorb underpad VWR 82004-836 Size: 43.2 x 60.1 cm (17 x 24")
Kimwipe Krackeler Scientific, Inc. 1945-34155-CS
Standard tripod Various
iSight camera or webcam Apple M8817LL/A Good for larger tadpoles but small ones are difficult to see
Portable computer Apple/PC Various We used a 13" MacBook, 2 GHz Intel Core 2 Duo running MacOSX Lion 10.7.5
MiniDV handycam camcorder SONY DCR-HC42 Connected by firewire to the computer with a 6-conductor and 4-conductor alpha FireWire 400 
Handycam station SONY DCRA-C121 This can be used for connecting firewire to camera
QuickTime Player software Quicktime Version 10.1
26 G Needle (5/8" length) VWR BD305115
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11295-10
Disposables
Gentamicin sulfate [50 mg/ml] Fisher Scientific 17-528Z Stored at RT
Sylgard 184 silicone elastomer Fisher Scientific NC9644388
Instant ocean Doctors Foster and Smith CD-116528 Stock solution = 100 g/L stored at RT
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S0876 Stock solution = 0.4 M stored at RT
In vitro fertilized embryos eNasco LM00490MX 100 embryos/unit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maurer, C. M., Huang, Y. Y., Neuhauss, S. C. Application of zebrafish oculomotor behavior to model human disorders. Rev Neurosci. 22 (1), 5-16 (2011).
  2. Solessio, E., Scheraga, D., Engbretson, G. A., Knox, B. E., Barlow, R. B. Circadian modulation of temporal properties of the rod pathway in larval Xenopus. J Neurophysiol. 92 (5), 2672-2684 (2004).
  3. Moriya, T., Kito, K., Miyashita, Y., Asami, K. Preference for background color of the Xenopus laevis tadpole. J Exp Zool. 276 (5), 335-344 (1996).
  4. Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7 (8), (2009).
  5. Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (1), 364-373 (2011).
  6. Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue determination using the animal cap transplant (ACT) assay in Xenopus laevis. J Vis Exp. 16 (39), (2010).
  7. Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).
  8. Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A second-generation device for automated training and quantitative behavior analyses of molecularly-tractable model organisms. PLoS One. 5 (12), (2010).
  9. Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS One. 6 (5), (2011).
  10. Dong, W., et al. Visual Avoidance in Xenopus Tadpoles is Correlated With the Maturation of Visual Responses in the Optic Tectum. J Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
  11. Lan, L., et al. Noggin Elicits Retinal Fate In Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 27 (9), 2146-2152 (2009).
  12. De Robertis, E. M., Kuroda, H. Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).

Tags

Неврология выпуск 88 глаз сетчатки зрение цвет предпочтение, Поведение свет руководство визуальный анализ
Простой Поведенческая Анализ для тестирования зрительной функции в<em&gt; Xenopus Laevis</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Viczian, A. S., Zuber, M. E. A… More

Viczian, A. S., Zuber, M. E. A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (88), e51726, doi:10.3791/51726 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter