الهياكل البالغة لذبابة الفاكهة مشتقة من هياكل تشبه الكيس تسمى الأقراص الخيالية. يوفر تحليل هذه الأقراص نظرة ثاقبة للعديد من العمليات التنموية بما في ذلك تحديد الأنسجة ، وإنشاء حدود المقصورة ، وتكاثر الخلايا ، ومواصفات مصير الخلية ، وقطبية الخلية المستوية. يستخدم هذا البروتوكول لإعداد أقراص خيالية للفحص المجهري الضوئي / الفلوري.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تشريح والمناعية من تخيلي أقراص من ذبابة الفاكهة السوداء البطن
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
جزء كبير من التنمية في مرحلة ما بعد الجنينية في ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة السوداء البطن، يحدث ضمن مجموعة من الهياكل التي تشبه الكيس تسمى أقراص تخيلي. هذه الأقراص تؤدي إلى نسبة عالية من الكبار الهياكل التي تم العثور عليها داخل ذبابة الكبار. نحن هنا وصف البروتوكول الذي تم الأمثل لاستعادة هذه الأقراص وإعدادهم للتحليل مع الأجسام المضادة للصحفيين النسخي والفخاخ البروتين. هو الانسب هذا الإجراء لأنسجة رقيقة مثل أقراص تخيلي، ولكن يمكن تعديلها بسهولة للاستخدام مع الأنسجة سمكا مثل اليرقات الدماغ والكبار المبيض. سوف بروتوكول مكتوبة والفيديو المصاحبة توجيه القارئ / المشاهد من خلال تشريح يرقات الطور الثالث، تثبيت الأنسجة، والعلاج من أقراص تخيلي مع الأجسام المضادة. بروتوكول يمكن استخدامها لتشريح أقراص تخيلي من الأصغر سنا يرقات الطور الأول والثاني كذلك. وميزة هذا البروتوكول هو أنه قصير نسبيا ولها أن تكونأون الأمثل للحفاظ جودة عالية من الأنسجة تشريح. ميزة أخرى هي أن الإجراء التثبيت أن يعمل يعمل بشكل جيد مع العدد الهائل من الأجسام المضادة التي تعترف البروتينات ذبابة الفاكهة. في تجربتنا، وهناك عدد قليل جدا من الأجسام المضادة الحساسة التي لا تعمل بشكل جيد مع هذا الإجراء. في هذه الحالات، فإن العلاج يبدو أن لاستخدام كوكتيل تثبيت البديل مع الاستمرار في اتباع المبادئ التوجيهية التي وضعناها عليها للخطوات تشريح وحضانات الأجسام المضادة.
المقدمة
لأكثر من قرن من الزمان ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة، فقد كان نظام رئيس الوزراء لدراسة تطوير والسلوك وعلم وظائف الأعضاء. ويمكن تقسيم تطور في الطيران إلى مرحلتين رئيسيتين: الجنينية وبعد الجنينية مع الكثير من أخذ مكان الأخير ضمن أحادي الطبقة الظهارة تسمى أقراص تخيلي 1-3. ونشرت رسومات من أقراص تخيلي لأول مرة في عام 1864 بحلول أغسطس ايزمان كجزء من له دراسة واسعة النطاق على التنمية الحشرات 1. هذه الأقراص تبدأ تنميتها خلال مرحلة التطور الجنيني، ونمط خلال مراحل اليرقات، البقاء على قيد الحياة تحلل النسج الهائل من المراحل المبكرة العذراء، وفي نهاية المطاف تؤدي إلى نسبة عالية من الكبار اله....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد يرقات
- ملء طبق بيتري 35 ملم مع عازلة تشريح.
- وضع اليرقات في طبق بتري والسماح لهم تسبح حولها لبضع دقائق (الخطوة التنظيف الذاتي).
- نقل اليرقات إلى مجموعة من العازلة تشريح على طبق تشريح القائمة على السيليكون. يجب أن تكون على حافة واحدة من لوحة هذا التجمع. تتكون لوحة تشريح حل السيليكون التي تم سكب وتصلب داخل طبق بتري الزجاج.
- باستخدام الماصة باستور، ضع مجموعة أكبر من العازلة تشريح في منتصف ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
طريقة الموضح أعلاه موثوق تنتج مواد ذات جودة عالية للتحليل مع تحقيقات في الموقع، للصحفيين النسخي، والفخاخ البروتين والأجسام المضادة. في الشكل 1 نعرض العين الهوائي، والأعضاء التناسلية، الجناح، haltere والساق الأقراص التي يتم استردادها بشكل روتيني مع هذا الأسلوب. وقد تمت معالجة هذه الأقراص مع fluorophore-phalloidin مترافق التي تربط لF-الأكتين وبالتالي يحدد كل خلية. إذا تم إصلاح الأنسجة بشكل صحيح ثم ثلم تخلقية من القرص العين، حواف الأنسجة متحدة المركز في طيات.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
على الرغم من أن هذا الإجراء قد ركزت بشكل كبير على العزلة ومعالجة لاحقة الأقراص العين antennal، فمن قابلة للتستخدم لعزل وتحليل الجناح، haltere والساق وأقراص التناسلية (الشكل 4). والتعديل الوحيد المطلوب من بروتوكول لعزل هذه الأقراص (على العكس من القرص العين antennal) هو طريقة تشريح الخشنة (القسم 2 من البروتوكول). تم العثور على أول الصدري الساق (T1) زوج في الجزء الأمامي من اليرقة ويمكن استرداد باتباع بروتوكول العين antennal القرص العزلة. ومع ذلك يتم إرفاق الساق الصدر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
نود أن نشكر دونالد جاهز وكيفن موسى لتعليم JPK وتخيلي إجراء تشريح القرص الأصلي. كما نشكر بوني Weasner للقرص الأعضاء التناسلية في الشكل 1B والقرص العين في الشكل 2A، براندون Weasner عن الشكل 3، ومركز بلومينغتون الأسهم ذبابة الفاكهة ذبابة عن البقع والضفة الدراسات التنموية ورم هجين عن الأجسام المضادة. وقد تم دعم CMS بواسطة راتبا من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) GCMS التدريب المنحة (T32-GM007757)، وجورج بوتنام زمالة أبحاث فرانك، وزمالة أبحاث روبرت بريجز. ويدعم JPK من خلال منحة من المعهد الوطني للعيون (R01 EY014863)
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Sylgard 184 سيليكون المطاط الصناعي كيت | داو كورنينج | 184 سيل إيلاست كيت 0.5 كجم | تستخدم لإنشاء قاعدة للوحة التشريح |
| بتري زجاجي بريكس 150 × 20 مم | داو كورنينج | 3160-152CO | استخدم الغطاء للوحة التشريح |
| # 5 ملقط تشريح | تيد بيلا | 525 | يجب أن تبقى الملقط حادة جدا |
| 9 بائعي زجاج | مشاهدة جيداتستخدم لتثبيت مجمعات القرص الخيالي | ||
| 50 مل قارورة Erlenmeyer | البائعين المختلفين شريط | ||
| التحريك الصغير | بائعين مختلفين | صغير بما يكفي لتناسب قارورة Erlenmeyer | |
| 50 مل أنابيب مخروطية بائعين | مختلفين | ||
| 1.5 مل أنابيب Microfuge | بائعين مختلفين | واضحين أو داكنين اعتمادا على التطبيق | |
| Microfuge Rack | مختلف البائعين مقاعد | ||
| البدلاء الدوار | مختلف البائعين | 100 &# 956; ل يجب ألا يتناثر الحجم عند إعداد منخفض | |
| بارافورمالدهايد | ماكرون للكيماويات | 2-26555-1 | يعمل كمثبت |
| فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة | Sigma Chemical Co | S-3139 | يستخدم لصنع التشريح وغسل المخازن |
| المؤقتة فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة | Sigma Chemical Co | 71636 | تستخدم لصنع التشريح والغسيل |
| Lysine | Acros Organics | 125221000 | تستخدم في محلول التثبيت |
| Sodium Periodate | Sigma Chemical Co | S-1878 | المستخدمة في محلول التثبيت |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | تستخدم لتثقيب الأقراص الخيالية |
| هيدروكسيد الصوديوم | EM Science | SX0593-3 | تستخدم لإذابة بارافورمالدهيد |
| 100٪ مصل الماعز العادي | مختبرات جاكسون | 005-000-121 | يعمل كمحلول مانع |
| الأجسام المضادة الأولية | البائعون | المختلفون يخففون في مصل الماعز بنسبة 10٪ وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة | |
| الأجسام المضادة الثانوية | البائعون | المختلفون يخفف في مصل الماعز بنسبة 10٪ وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة | |
| المجسات الجزيئية | Vectashield | H-1000 | يمنع تبيض العينات |
| شرائح المجهر | فيشر العلمي | 48312-003 | |
| غطاء زجاجي زلات 18 × 18 مم | Fischer Scientific | 12-542A | |
| Kimwipe Tissue | بائعين | مختلفين يمنع الشرائح الزجاجية من الالتصاق بقاعدة السيليكون | |
| فرشاة بانيت 000 | العديد من البائعين | لخفض الغطاء برفق على العينات |
المراجع
- Weismann, A. Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria. Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 Forthcoming.
- Cohen, S. M. Imaginal disc development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 747-841 (1993).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
