عزل الخلايا اللحمية للعقدة الليمفاوية هو إجراء متعدد الخطوات بما في ذلك الهضم الأنزيمي والتفكيك الميكانيكي للحصول على الخلايا الشبكية الليفية والخلايا اللمفاوية والخلايا البطانية الدموية. في الإجراء الموصوف ، يتم الجمع بين الهضم القصير والتصنيف الميكانيكي الآلي لتقليل تدهور علامة السطح للخلايا اللحمية للعقدة الليمفاوية القابلة للحياة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل خلايا الفئران العقدة الليمفاوية اللحمية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تتكون الأعضاء اللمفاوية الثانوية بما في ذلك الغدد الليمفاوية من خلايا لحمية توفر بيئة هيكلية للتوازن وتنشيط وتمايز الخلايا الليمفاوية. تم تحديد مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا اللحمية من خلال التعبير عن جزيء الالتصاق CD31 وبروتين سكري بودوبلانين (gp38) ، والخلايا الشبكية في المنطقة التائية أو الخلايا الشبكية الليفية ، والخلايا البطانية اللمفاوية ، والخلايا البطانية الدموية ، والخلايا الحمضية الشبيهة ب FRC داخل مجموعة الخلايا السالبة المزدوجة. بالنسبة لجميع السكان ، يتم وصف وظائف مختلفة بما في ذلك فصل وتبطين المقصورات المختلفة ، وجذب أنواع الخلايا المختلفة والتفاعل معها ، وترشيح سوائل التصريف وتقلص الأوعية اللمفاوية. في السنوات الماضية ، وصفت مجموعات مختلفة دورا إضافيا للخلايا اللحمية في تنظيم وتنظيم استجابات الخلايا التائية السامة للخلايا التي يحتمل أن تكون خطرة على المضيف.
الغدد الليمفاوية هي هياكل معقدة بها العديد من أنواع الخلايا المختلفة وبالتالي تتطلب إجراء مناسبا لعزل مجموعات الخلايا المرغوبة. حاليا ، تعتمد بروتوكولات عزل الخلايا اللحمية في العقدة الليمفاوية على الهضم الأنزيمي مع أوقات حضانة متفاوتة. ومع ذلك ، فإن الخلايا اللحمية وجزيئاتها السطحية حساسة لهذه الإنزيمات ، مما يؤدي إلى فقدان تعبير علامات السطح وموت الخلايا. هنا يقترح بروتوكول هضم إنزيمي قصير جنبا إلى جنب مع الاضطراب الميكانيكي الآلي للحصول على خلايا مفردة قابلة للحياة لتعليق الخلايا اللحمية للعقدة الليمفاوية مع الحفاظ على تعبير جزيئاتها السطحية.
المقدمة
الغدد الليمفاوية هي مقصورات المتخصصة حيث بدأت الاستجابات المناعية التكيفية ضد المستضدات الذاتية والخارجية ومنسقة. الإجراء المقدمة هنا يصف الهضم الأنزيمي قصيرة جنبا إلى جنب مع pipetting لالميكانيكي الآلي للحصول على العقدة اللمفاوية وحيدة الخلية تعليق والوصول إلى خلايا انسجة العقدة الليمفاوية قابلة للحياة التي تحافظ على التعبير السطح العديد من الجزيئات.
الخلايا اللحمية العقدة الليمفاوية تشكل سقالة من العقدة الليمفاوية والوفاء ثلاث وظائف رئيسية: أولا أنها تصفية سوائل الجسم لأخذ عينات المستضدات، ومسببات الأمراض والعوامل المسببة للأمراض المرتبطة نمط الجزيئية الخاصة....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
في هذا المنشور الفيديو والبروتوكول، وأجريت كافة الإجراءات الحيوانية وفقا لبروتوكول الحيوانية التي وافقت عليها السلطة كانتون بازل شتات، سويسرا.
1. إعداد العقد الليمفاوية والهضم
- الماء قبل الحرارة في كوب إلى 37 درجة مئوية على النمام المغناطيسي مع لوحة التدفئة.
- إعداد المتوسطة الأساسية على النحو التالي: DMEM المتوسطة (دون البيروفات) تستكمل مع FCS 2٪، 1.2 مم CaCl 2 و القلم / بكتيريا (100 وحدة من البنسلين، 100 ميكروغر....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هذا البروتوكول هو بروتوكول الهضم تعديل نشرتها رابط وآخرون، 2007 6 مع أقصر وقت الهضم (45 دقيقة كحد أقصى) بسبب التقسيم الميكانيكية مع ماصة الأقنية الآلي. بالإضافة إلى ذلك، هذا الإجراء هو أكثر توحيدا، ويقلل من تدهور علامات على سطح خلايا انسجة مختلفة العقدة الليمفاوية ويسمح التعامل مع عينة أكثر من واحد في نفس الوقت.
كولاجيناز الرابع وكولاجيناز D سريعة في البروتوكول 6 و البروتوكول الحالي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
دراسة خلايا انسجة العقدة الليمفاوية أصبحت في الآونة الأخيرة التركيز على البحوث نظرا لتطوير بروتوكولين الهضم نشرت 6،13. كلا البروتوكولين كافية للحصول على الخلايا الليمفاوية واحد العقدة انسجة ولكنها تختلف في استخدام إنزيمات الهضم ووقت الهضم. منذ خلايا انسجة وعلامات سطحها حساسة للالهضم الأنزيمي والإجهاد الميكانيكي، مطلوب بروتوكول الأمثل.
عزل خلايا العقدة الليمفاوية انسجة قابلة للحياة من تشريح العقدة الليم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون سانجيف لوثر وزملاؤه على المناقشات المفيدة في إنشاء بروتوكول هضم العقدة الليمفاوية الحالي. تم دعم هذا العمل من خلال منح SNF PPOOA-_119204 و PPOOP3_144918 ل S.W.R.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| DMEM | LifeTechnologies-Gibco | 41965-039 | |
| FCS | التركيز النهائي 2٪ | ||
| CaCl2 | Sigma | 499609 | التركيز النهائي 1.2 ملي مولار |
| كولاجيناز IV | Worthington Biochemical Corporation | >160 وحدة لكل مجم من الوزن الجاف ، استخدم بالتركيز النهائي 1 مجم / مل | |
| كولاجيناز دي | روش | 11088882001 | يستخدم بمعدل 3.5 مجم / مل |
| DNAse I | Roche ؛ | 11284932001 | الاستخدام عند 40 & ميكرو ؛ جم / مل |
| مغناطيس التحريك | FAUST | بطول 5 مم - 2 مم & oslash ؛ | |
| أنابيب دائرية القاع من البوليسترين 5 مل | Falcon-BD Bioscience | ||
| مغناطيسي مع وظيفة التسخين | IKA-RCT- معيار | 9720250 | |
| أطباق بتري 100 مم ، معقمة | TPP | 6223201 | |
| 25 جم إبر | Terumo | ||
| مضاد للفأر CD45 Ab | Biolegend | Clone 30-F11 | |
| مضاد للفأر CD11c Ab | Biolegend | Clone N418 | |
| مضاد للفأر Podoplanin Ab | Biolegend | Clone 8.1.1 | |
| مضاد للماوس CD31 Ab | Biolegend | Clone MEC13.3 | |
Eppendorf Xplorer plus ، متعدد القنوات | Eppendorf | 4861 000.821 / 830 | 1.250 & micro ؛ ل الحد الأقصى للحجم |
| المضاد للماوس CD140a | Biolegend | Clone APA5 | |
| المضاد للماوس CD80 | Biolegend | Clone 16-10A1 | |
| المضاد للماوس CD40 | Biolegend | Clone 1C10 | |
| مكافحة الماوس I-Ab | Biolegend | Clone AF6-120.1 | |
| مكافحة الماوس CD274 (PD-L1) Biolegend | Clone 10F.9G2 | ||
| LIVE / DEAD Fixable طقم بقع الخلايا الميتة القريبة من الأشعة تحت الحمراء | Invitrogen | L10119 |
المراجع
- Mueller, S. N., Ahmed, R. Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses. Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).
- Roozendaal, R., Mebius, R. E. Stromal Cell - Immune Cell Interactions. Annual Review of Immunology. 29 (1), 23-43 (2011).<....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
