تسمح تقنية التصوير المحسنة بالتصوير ثلاثي الأبعاد للأعضاء أثناء النمو. نصف هنا نظام زراعة الأعضاء الكامل الذي يسمح بالتصوير الحي للزغابات النامية في أمعاء فأر الجنين.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
نظام الثقافة الماوس الجنين الأمعاء الجامعة ل فيفو السابقين التلاعب في مسارات إشارات وتصوير لايف ثلاثي الأبعاد التنمية الزغبة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تم الاستدلال معظم عمليات التخلق في الأمعاء من الجنين أقسام رقيقة من الأنسجة الثابتة، وتوفير لقطات من التغيرات على مدى مراحل النمو. المعلومات ثلاثي الأبعاد من أقسام مسلسل رقيقة يمكن أن يكون تحديا لتفسير بسبب صعوبة إعادة بناء أقسام التسلسلية تماما والحفاظ على التوجه السليم للأنسجة على أقسام التسلسلية. النتائج الأخيرة من قبل غروس آخرون، 2011 تسليط الضوء على أهمية ثلاثية الأبعاد في فهم المعلومات التشكل من الزغب النامية في الأمعاء 1. أظهرت إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد من الخلايا المعوية المسمى منفردة أن غالبية الخلايا الظهارية في الأمعاء اتصل كل من الأسطح قمية والقاعدية. وعلاوة على ذلك، أظهرت إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد من الهيكل الخلوي الأكتين على السطح القمي من ظهارة أن لمعة الأمعاء مستمرة وأن شمعة الثانوية وقطعة أثرية من لياليectioning. تلك نقطتين، جنبا إلى جنب مع تظاهرة الهجرة النووية interkinetic في الظهارة المعوية، ويعرف ظهارة الأمعاء النامية بصفة ظهارة مطبقة كاذبة وليس طبقية كما كان يعتقد سابقا 1. كانت القدرة على مراقبة ظهارة ثلاثة الأبعاد-المنوية لإثبات هذه النقطة، وإعادة التشكل الظهارية في الأمعاء الجنين. مع تطور تكنولوجيا التصوير متعدد الفوتون وبرامج إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد، والقدرة على تصور سليم، وتطوير أجهزة يتحسن بسرعة. ثنائي الفوتون الإثارة تتيح اختراق أقل ضررا أعمق في الأنسجة مع ارتفاع القرار. التصوير ثنائي الفوتون وإعادة الإعمار 3D من الأمعاء بأكملها الماوس الجنين في التون وآخرون، 2012 ساعد على تحديد نمط زغابة ثمرة 2. نحن هنا وصف نظام الثقافة الجهاز كله الذي يسمح فيفو السابقين تطوير الزغب وملحقات هذا النظام للسماح للثقافةالأمعاء لتكون ثلاثة الأبعاد تصويرها خلال تنميتها.
المقدمة
تتكون كل زغابات معوية من جزأين رئيسيين للنسجة: طبقة سطحية ظهارية ونواة وسيطة. تتشكل الأمعاء الدقيقة للفأر في اليوم الجنيني 10 عندما تغلق ورقة من الأديم الباطن وتغلق لتشكيل أنبوب من الظهارة محاط بخلايا اللحمة المتوسطة3. يخضع هذا الأنبوب المسطح من الظهارة لتكاثر سريع ، وينمو في الطول والمحيط ويخضع لعمليات إعادة ترتيب دراماتيكية تنطوي على تغييرات ديناميكية في شكلالخلية 1. في الوقت نفسه ، يخضع اللحمة المتوسطة المحيطة أيضا للعديد من العمليات التنموية بما في ذلك تكوين الضفيرة الوعائية ، وتمايز العضلات الملساء وتجنيد الخلايا العصبية المعوية4. في الأمعاء الدقيقة القريبة في اليوم الجنيني 14.5 ، تبدأ التكثيفات (المجموعات) من الخلايا المستجيبة للقنفذ و PDGF في التكون بجوار الظهارة2،5. يستمر تكوين العناقيد الوسيطة في الانتشار على طول الأمعاء بحيث تغطي الأمعاء الدقيقة بأكملها بحلول اليوم الجنيني 16.52. مع تشكل المجموعات الوسيطة ، تبدأ الخلايا الظهارية الأقرب إلى العناقيد في الانسحاب من دورة الخلية ، بينما تستمر الخلايا الظهارية الأخرى في التكاثر. تبدأ تلك الخلايا الموجودة مباشرة فوق مجموعة اللحمة المتوسطة التي انسحبت من دورة الخلية في تغيير شكلها حيث تنقبض الزغابات الناشئة في التجويف. ويعزى النمو الإضافي للزغابات جزئيا إلى الانتشار المستمر للظهارة بين الزغابات الناشئة. تظل مجموعات اللحمة المتوسطة ملتصقة بإحكام بظهارة الزغابات المتنامية وتستمر في التعبير عن مجموعة متنوعة من جزيئات الإشارة. تنتشر موجة ظهور الزغابات على طول الأمعاء الدقيقة بعد تكوين مجموعات اللحمة المتوسطة. مع استمرار نمو الأمعاء وتمتد منطقة الزغابات بين الزغابات الناشئة ، تتشكل مجموعات اللحمة المتوسطة الجديدة بجوار ظهارة intervillus وينتج عن ذلك جولات أخرى من ظهور الزغاباتونموها 6.
< p class = 'jove_content'> يعد التطور المتزامن للظهارة واللحمة المتوسطة ضروريا لتشكل الزغابات. تفرز جزيئات الإشارات من طبقة إلى أخرى حيث تستقبل المستقبلات رسالة الإشارة وتحولها من أجل تنسيق التطور بين الظهارة واللحمة المتوسطة. تعمل العناقيد الوسيطة كمراكز إشارات وتعبر عن مجموعة متنوعة من الأشكال التنموية7-10. يؤدي تعطيل تكوين الكتلة أو النمط إلى فقدان ظهور الزغابات ونمطها. ينتج عن تثبيط إشارات PDGF عدد أقل من المجموعات وعدد أقل من الزغابات وتلك الزغابات التي تتشكل مشوهة بعد المجموعات غير الطبيعية11. يؤدي فقدان إشارات القنفذ إلى فقدان كامل لتكوين الكتلة وفشل ظهور الزغابات2،12. توضح هذه البيانات معا أن العناقيد تنسق تطور ظهارة الزغابات مع قلبها الوسيط.باستخدام نظام ثقافة الأعضاء بأكمله ، نحن قادرون على تغيير الإشارات المتضمنة في الحديث المتبادل العنقودي الظهاري الوسيط لتحديد دور تلك الإشارات في تكوين الزغابات. يوفر التقسيم البصري متحد البؤر ثنائي الفوتون وإعادة البناء القدرة على تصور تكوين الكتلة وظهور الزغابات في ثلاثي الأبعاد وفهم العلاقات المكانية بين العناقيد الوسيطة والظهارة المغطى بها بشكل أفضل. من خلال توسيع نظام الثقافة إلى أربعة أبعاد ، يمكننا التقاط مجموعات z-stacks من المجموعات والزغابات النامية بمرور الوقت ومراقبة هذه التفاعلات. في النهاية ، فإن القدرة على متابعة تطور الزغابات بهذه الطريقة ومراقبة التغييرات التي تحدث مع الإشارات المتغيرة ستحدث ثورة في فهم التفاعلات الوسيطة الظهارية في تكوين الزغابات.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: تم التعامل مع جميع الفئران إنسانية باستخدام بروتوكولات المعتمدة من قبل جامعة ميشيغان كلية الطب حدة لمختبر الطب الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الجامعة على استخدام ورعاية الحيوانات.
1. كامل نظام الجهاز ثقافة
- إعداد وسائل الإعلام والثقافة لوحات
- في ثقافة غطاء محرك السيارة الأنسجة، وإزالة 5 مل من BGJb سائل الإعلام من الزجاجة الأسهم وإضافة 5 مل من القلم / بكتيريا. إعداد الأوراق المالية تعمل وسائل الإعلام في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل، وذلك بإضافة 1 مل من 5 ملغ / مل حمض الاسكوربيك إلى 49 مل من BGJb سائل الإعلام (مع القلم / بكتيريا).
- إعداد لوحة الثقافة 6 جيدا وذلك بإضافة 1 مل تحت كل من transwells.
ملاحظة: إذا لم يتم استخدام جميع transwells 6، نقل transwells اضافية الى معقمة وحة 6 جيدا العذبة لاستخدامها لاحقا. إضافة 3 مل من العمل BGJb سائل الإعلام إلى كل من ثلاثة أطباق بتري 10 سم معقمة.
- التحضير للتشريح
- نقع أدوات تشريح في 70٪ ethaنول وتأكد للحفاظ على الأدوات نظيفة أثناء العمل.
- إعداد منطقة تشريح مع دلو الجليد كبيرة ووضع لوحة الثقافة 6 جيدا و10 سم أطباق بتري مع BGJb سائل الإعلام على الجليد. العمل على الجليد قدر الإمكان بينما تشريح وإعداد الأمعاء للثقافة.
- تخدير الفئران الإناث البالغين في الغرفة مع isofluorane (100 ميكرولتر) قبل euthanization خلع عنق الرحم لحصاد أمعاء الجنين.
- بعد حصاد الأجنة من الأم، كل مرحلة الجنين بعناية وفقا لتنظيم تايلر الرسم البياني 13. لا تعتمد على أيام ما بعد الجماع لتحديد عمر الجنين كما كل الاختلافات تصل إلى 24 ساعة في مرحلة التطوير لوحظ بشكل روتيني داخل القمامة واحدة.
- تشريح للأمعاء الجنين
- الموت ببطء الأجنة بواسطة قطع الرأس قبل إزالة الأمعاء.
- كل تشريح الأمعاء في 1X Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS) ثم جيش التحرير الشعبى الصينىم قبل أن تتحول إلى 10 سم لوحة بتري مع العمل BGJb سائل الإعلام.
- إزالة بعناية من الطحال والمعدة والبنكرياس من المعدة والاثني عشر العلوي.
- فصل بلطف الثرب مع الحرص على ترك الثرب المرفقة قدر الإمكان وفصل الاتصالات فقط بما يكفي للسماح الأمعاء ليتم تقويمها.
ملاحظة: للحصول على الأمعاء أقدم من E14.5 أو تلك التي يجري زرعها أطول من 24 ساعة، فصل بلطف الأمعاء إلى 3 شرائح متساوية للسماح لتدفق محتويات اللمعية من خلال الأمعاء ويطرد من خفض الغايات. ومع ذلك، للثقافات التي قبل E13.5، والانتظار حتى بعد 24 ساعة من زراعة قبل فصل 3 شرائح من الأمعاء للسماح للالمصلية أن ينمو بشكل صحيح على طول الأمعاء. - استخدام الماصة الفم لنقل القطع المعوية على transwells لوحة الثقافة (1.1.2).
- إعادة بلطف الأمعاء حسب الحاجة بحيث تكون مباشرة عبر transwelلتر.
ملاحظة: عندما تبدأ الأمعاء تتحرك محتويات اللمعية من خلال أنبوب، فإن أي مكامن الخلل في الأمعاء يسبب نسخة احتياطية وتلف الأمعاء.
- ثقافة والعلاج
- إزالة وسائل الإعلام من تحت transwell، إضافة 700 ميكرولتر من وسائل الإعلام العلاج (وسائل الإعلام العمل مع البروتينات المؤتلف المضافة أو مثبطات الدوائية) تحت transwell.
- إضافة 300 ميكرولتر من وسائل الإعلام العلاج قطرة من الحكمة في أعلى الأمعاء والسماح لها نقع من خلال transwell. إعادة الأمعاء عند الضرورة.
- تغيير العلاج وسائل الإعلام على الأقل مرة واحدة يوميا أو أكثر في كثير من الأحيان تبعا لعمر النصف للكاشف العلاج.
- إعداد البروتين غارقة الخرز الاغاروز عن مصدر المترجمة من كاشف العلاج
- resuspend والخرز الاغاروز في حاوية تخزين ونقل 100 ميكرولتر من الخرز agarose في أنبوب 1.5 مل microfuge.
- ملء حجم ما تبقى من الأنبوب عقيمة مع 1X دكتوراهosphate مخزنة المالحة (PBS) وتخلط حبات لغسلها. وضع microfuge أنبوب في رفوف لبضع دقائق للسماح للالخرز لتستقر في القاع ثم الماصة قبالة PBS من على أعلى من الخرز. إعادة ملء microfuge أنبوب معقم مع 1X PBS وتكرار عملية الغسيل مرتين أكثر.
- إعداد البروتين من الفائدة مرتين في التركيز المطلوب لتلقي العلاج.
- مزيج 5 ميكرولتر من الخرز agarose غسلها مع 5 ميكرولتر من الأسهم البروتين 2X وتستنهض الهمم بلطف حبات في البروتين. وضع أنبوب على الجليد لمدة 1 ساعة، والخلط بلطف كل 10-15 دقيقة.
- شطف حبات لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني 1X معقم قبل وضع الخرز على الأمعاء.
- وضع حبات الاغاروز
- ضع بلطف حبات الاغاروز على رأس الأمعاء باستخدام الماصة الفم مع الإبر سحبت الشعرية. وضع الخرز مع الحذر الشديد والتعامل معها بخشونة وتلف الأمعاء ومنع تطوير زغابة في المنطقة المصابة.
- وضع ضعف عدد حبات كانت هناك حاجة لتحليل منذ الأمعاء سيخضع الحركات وتحوي حوالي نصف من الخرز توضع سوف لفة الخروج من الأمعاء خلال وقت زراعة.
- تثبيت الأمعاء مثقف
- إزالة بعناية وسائل العلاج من تحت transwell والسماح للأمعاء إلى الهواء الجاف لمدة 3 دقائق.
- إضافة 1 مل من تثبيتي تحت transwell لمدة 2 دقيقة، ثم تغطية الجزء العلوي من الأمعاء مع 2 مل من تثبيتي للفترة المتبقية من الوقت التثبيت. مع تحديد بارافورمالدهيد 4٪ O / N عند 4 درجات مئوية أو لمدة 2 ساعة على RT.
2. التصوير من الأمعاء الثابتة
- التصوير Wholemount
- وضع الامعاء كلها (مع مضان الذاتية) على شريحة مع 100 ميكرولتر من 1X DPBS. استخدام ملقط لترتيب بلطف الأمعاء.
- استخدام مختبر الأنسجة لإزالة بعناية DPBS وإضافة على الفور 100 ميكرولتر من 70٪ الجلسرين لجعل مو الأنسجةإعادة شفافية وزيادة عمق ممكن من التصوير.
ملاحظة: إذا كان المطلوب مزيدا من تغلغل الأمعاء، بدلا من تركيب الأمعاء في 70٪ الجلسرين، ونقع في الأمعاء بضع قطرات من محلول تركيز واضح لمدة 10-30 دقيقة. الماصة قبالة الحل تركيز واضح وجبل مع جبل الأمعاء واضح. - تغمس كل من الزوايا الأربع من ساترة إلى الصلصال والتقاط كمية صغيرة من الطين لاستخدام الفواصل بين الشرائح وساترة للحفاظ على ساترة من تسطيح الأمعاء.
- ختم ساترة على الشريحة مع VALAP ذاب تطبيقها مع مسحة القطن.
- صورة الأمعاء على أي مجهر متحد البؤر تستقيم أو مقلوب. يرجى الرجوع إلى المناقشات لمزيد من التفاصيل.
- Vibratome باجتزاء من الأمعاء الثابتة (عن وجهة مستعرضة هياكل المعوية)
- في الأمعاء تضمين 7٪ الاغاروز في قوالب بلاستيكية صغيرة (10 × 10 × 15 مم) وتسمح للكتل الاغاروز ليبرد ويصلب.
- إزالة كتل الاغاروز من القوالب البلاستيكية والغراء كتل الاغاروز إلى مرحلة جمع vibratome مع الغراء الفورية.
- ملء مرحلة جمع مع الجليد الباردة 1X DPBS.
- قطع الفروع في سمك بين 100-150 ميكرون. لأقسام سمكا تستخدم حلول المقاصة (الموصوفة في القسم 2.1.2) لتصور أعمق في المقطع العرضي.
- صب vibratome المقاطع من مرحلة جمع في بئر من لوحة 6 جيدا للتخزين عند 4 درجات مئوية.
- المناعي تلطيخ والأنسجة vibratome مقطوع ثابت
- وضع 5-12 أقسام vibratome لكل بئر في لوحة 24 جيدا مع 1X DPBS.
- إزالة 1X DPBS وإضافة 500 ميكرولتر من حل permeabilization لكل بئر. بلطف الصخور العينات لمدة 25 دقيقة في RT.
- بعد permeabilization، وغسل العينات 3 مرات مع 1X PBS.
- منع عينات لمدة 30 دقيقة على الأقل في 500 ميكرولتر من عرقلة الحل.
- بعد حجب، والبريدالتبادل عرقلة الحل مع 500 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية مخففة في عرقلة الحل والحفاظ على العينات عند 4 درجات CO / N.
ملاحظة: التخفيفات الأجسام المضادة الأولية التي تعمل بشكل جيد على أقسام المجمدة والبارافين يعمل بشكل جيد عموما على vibratome أقسام أيضا، ولكن الأجسام المضادة التي تتطلب استرجاع مستضد النووي عموما لا تعمل بشكل جيد مع هذا البروتوكول (مثل BrdU). - في اليوم التالي، وغسل العينات 3 مرات لمدة 15 دقيقة في كل مرة مع عرقلة الحل.
- بعد الغسيل، وتطبيق 500 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية مخففة في عرقلة الحل. التفاف 24 لوحة جيدا في رقائق الألومنيوم لحماية fluorophores من ضوء والصخور العينات لمدة 45 دقيقة إلى 2 ساعة على RT.
- غسل العينات 3 مرات مع 1X PBS لمدة 15 دقيقة لكل وجبل الأقسام vibratome على الشرائح كما هو موضح في القسم 2.4.
- تصاعد vibratome أقسام
- إعداد الشرائح لvibratome تصاعد طريق قطع شرائح رقيقة المزدوج الأمراض المنقولة جنسياالشريط المسيخ ووضعها على طول الجانبين طويلة من الشرائح.
- وضع بعناية 5-10 أقسام vibratome بين الشريط المزدوج عصا على الشرائح في قطرة من 100 ميكرولتر من 1X PBS.
- تتكشف جميع أقسام ونشرها للخروج الى طبقة واحدة عبر الشريحة.
- إزالة أي الاغاروز الزائد أو بت متفاوتة يحول دون ساترة من الجلوس شقة.
- استخدام بعناية مختبر الأنسجة لامتصاص الزائد 1X PBS من مختلف الأقسام vibratome.
- إضافة قطرة من مائي المتوسطة المتزايدة على رأس من المقاطع vibratome ثم ساترة.
- ختم لل coverslips على الشرائح مع ذاب تطبيق VALAP مع مسحة القطن.
- صورة المقاطع vibratome على أي مجهر متحد البؤر رأسي أو مقلوب. يرجى الرجوع إلى المناقشات لمزيد من التفاصيل حول اختيار نظام التصوير.
3. تصوير لايف من الأمعاء كامل
الأمعاء تحصد من fetuseق بعد E12.5، مع الثرب متصل يقم سليمة، ووضع بنجاح الزغب في الثقافة باستخدام النظام المذكور أعلاه. وبالتالي، يسمح هذا النظام خارج الحي القبض على الصور الحية ض جزء من الأمعاء النامية التي يمكن بناؤها للحصول على عرض ثلاثي الأبعاد من التشكل مع مرور الوقت.
- وضع التصوير الحي
- استخدام الغراء الفورية الالتزام غشاء البولي الفردي إلى شاشة شبكة غرامة. وهذا يوفر سقالة الدعم لعقد الأمعاء في مكان تحت عدسة غمس المجهر مبائر تستقيم. يرجى الرجوع إلى قسم النقاش لمزيد من التفاصيل بشأن اختيار المجاهر التصوير الحية.
- وضع شاشة شبكة في وسط بئر من لوحة الثقافة.
- وضع تشريح الأمعاء على الغشاء البولي وإضافة قطرة من الغراء الفورية على حد سواء. استخدام الغراء فقط ما يكفي لتركيب الأمعاء، ولكن لا معطف ذلك!
- إضافة ثقافة الإعلام خالية من الفينول الأحمر تحت البوليالغشاء في وسط بئر من لوحة الثقافة.
- إضافة الماء إلى الحافة الخارجية للوحة الثقافة لتوفير الرطوبة.
- منذ الأمعاء الجنين يخضع موجات تشبه تحوي من انكماش في الثقافة، إضافة 100 ميكرولتر من 1: 5 من حل زيلازين في برنامج تلفزيوني 1X إلى 3 مل من وسائل الإعلام للسيطرة على حركة الأمعاء أثناء التصوير. وهذه الجرعة سيطرة الحركات المعوية لمدة 8-10 ساعة دون المساس تطوير زغابة.
- للحصول على عرض عرضية من الأمعاء، تضمين الأمعاء الحية في حل الاغاروز 3-4٪ وخفض أبواب سميكة (150-500 ميكرون) على vibratome. تتناسب مع صلابة من الاغاروز مع صلابة من الأمعاء يجري قص وتحدد تجريبيا المرحلة التنموية. عموما، حل الاغاروز 3٪ يعمل بشكل جيد للأمعاء الذين تقل أعمارهم عن E14.5 وحل 4٪ يعمل بشكل جيد للأمعاء E15-E16.
- الغراء الأقسام vibratome إلى غشاء البولي اضافته على شاشة شبكة (كما في القسم 3.1.1) والثقافة كما وصفها في القسم 3.1.2-3.1.6.
- إجراء التصوير الحي باستخدام ثنائي الفوتون مضان المجهر متحد البؤر (ليزر الإثارة بين 690-1،040 نانومتر) على الوقوف بشكل مستقيم مع جدول الانضباطي.
- ثنائي الفوتون الليزر ضبطها إلى 900 نانومتر يوفر الاختراق العميق مع أفضل قرار لإشارات GFP. أنه يقلل من الأضرار التي لحقت الأنسجة أثناء التصوير. بالإضافة إلى ذلك، وضع قوة الليزر إلى أدنى الانبعاثات الممكن يقلل من تلف الأنسجة. عادة للحصول على الإثارة جيدة من GFP، واستخدام السلطة 12٪ على الليزر ثنائي الفوتون.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في ثقافة Explants كاملة من أمعاء الجنين يسمح للتحليل الموقع، والتوزيع، ومدة الجزيئات مما يشير إلى أن تنسيق التنمية المعوية، حيث أن هذا النظام يمكن التلاعب في الإشارات مع الكواشف الدوائية أو البروتينات المؤتلف. نظام الثقافة transwell (الشكل 1A، مستنسخة من التون وآخرون، 2012) 2 يوفر واجهة الهواء السائل، مما يجعل من الممكن لوضع بالمخدرات أو البروتين غارقة الخرز الاغاروز على الأنسجة وبالتالي إنشاء مصادر الإشارات المحلية (الشكل 1B )...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الطبيعة الديناميكية والتفاعلات المعقدة للأنسجة الأمعاء وضع التصور 3D تتطلب أن يكون التقدير الكامل لهذه الأحداث التخلق. مع تطور تكنولوجيا التصوير، والقدرة على فحص زغابة التشكل بالتفصيل على تطوير / تحسين ومعها، وتعزيز فهم التواصل والتفاعل المكاني خلال توالد بشكل كبير.
كما تم اختبار طرق بديلة لزراعة الأمعاء بأكملها، ولكن يبقى نظام transwell الأكثر موثوقية لمرات أطول الثقافة والحفاظ على طبيعية العنقودية وزغابة الزخرف...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي صراعات مالية للكشف عنها.
شكر وتقدير
نعرب عن امتناننا للدكتورة ديبورا إل جوموسيو كمستشارة لنا ولدعمها الذي لا يقدر بثمن في تحديد الثقافة وطرق التصوير. نشكر أيضا الدكتور جيم برودي ، والدكتور هونغ شيانغ لو ، والدكتورة شارلوت ميستريتا ، والدكتورة آن جروس على مساهماتهم في تطوير نظام زراعة أعضاء الأمعاء بأكملها. قدمت المناقشات المفيدة حول التصوير نصائح ممتازة من الدكتور تشيب مونتروز ومايكل تشيروينسكي وساشا مشينشي. تم إجراء جميع عمليات التصوير في مختبر الفحص المجهري وتحليل الصور بجامعة ميشيغان. تم تقديم الدعم التمويلي من قبل NIH R01 DK065850.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ملقط تشريح دقيق | أدوات العلوم الدقيقة | 11254-20 | زوجان 70 |
| ٪ إيثانول | |||
| 1x محلول ملحي معقم من Dulbecco (DPBS) | Gibco & nbsp ؛ | 14040-133 | 500 مل |
| 6 ألواح آبار Costar | 3516 | ||
| 24 ألواح بئر | Costar ؛ | 3524 | |
| 60 × 15 مم أطباق بتري | Falcon | ؛ 451007 | |
| ألواح Transwell ، إدراج 24 مم ، أغشية بولي كربونات 8.0 مم | Corning Costar & nbsp ؛ | 3428 | 6 إدراج لكل لوحة |
| BGJb وسائط | Invitrogen | 12591-038 | 500 مل |
| PenStrep (10,000U / مل البنسلين ؛ 10,000 مجم / مل ستربتومايسين) | Gibco | ؛ 15140 | |
| حمض الأسكوربيك | سيجما | A0278 | يجعل 5 ملغ / مل مخزون ، مرشح ، aliquot وتخزينه في -20 درجة ؛ C |
| ماصة الفم (Drummond 1-15 بوصة أنبوب الشفاطة) | فيشر | & nbsp ؛ 21-180-10 | قم بإزالة مجموعة الشفاط واستبدله ب 1,000 & micro ؛ ل طرف الماصة الذي يعمل كمحول لتوصيل ماصة باستور زجاجية مقاس 6 بوصات. |
| 6 بوصة زجاج باستور ماصات | |||
| شعرية العالم | أدوات الدقة | TW100F-4 | سحب إلى الإبر |
| 4٪ بارافورمالدهايد | مصنوعة في 1 × PBS ، درجة الحموضة إلى 7.3 | ||
| لوحات ثقافة Falcon | & nbsp ؛ | 353037 | |
| شاشة الفولاذ المقاوم للصدأ شبكة دقيقة | في متجر | ||
| أغشية البولي كربونات | توماس العلمية | 4663H25 | بدلا من ذلك ، قطع أغشية Corning Costar 3428 من transwell يدعم |
| شراء الغراء الفوري | في هلام متجر لاجهزة الكمبيوتر | على أساس مفضل | |
| 35 × 10 مم لوحات | Falcon & nbsp ؛ | 351008 | |
| 7٪ agarose | Sigma | A9414 | إعداد ث / الخامس في 1x DPBS, التسخين لتذوب في حمام مائي |
| دبابيس دقيقة | أدوات العلوم الدقيقة | 26002-20 | |
| الفينول الأحمر الخالية من الوسائط (DMEM) | Gibco | 21063-029 | |
| زيلازين (100 مجم / مل) | AnaSed | 139-236 | |
| Matrigel | BD | 356231 | مصفوفة غشاء القاعدية ، عامل النمو المخفض ، الفينول الخالي من الأحمر |
| 3-4٪ agarose | Sigma & nbsp ؛ | A9414 | إعداد w / v في 1x DPBS ، تسخين ليذوب في حمام مائي |
| تصوير الأمعاء | |||
| اسم المواد / المعدات | الشركة | رقم الكتالوج | التعليقات / الوصف |
| الفازلين | في الصيدلية | المستخدمة في صنع VALAP: أجزاء متساوية من الفازلين ، اللانولين ، البارافين | |
| لانولين | سيجما & nbsp ؛ | يستخدم L7387 | لصنع VALAP: أجزاء متساوية من الفازلين واللانولين والبارافين |
| البارافين | Surgipath | 39601006 المستخدمة في صنع VALAP: أجزاء متساوية من الفازلين واللانولين والبارافين | |
| 70٪ الجلسرين في 1 × PBS | |||
| Focus clear و Mount Clear | CelExplorer Labs Co. | F101-KIT | |
| شراء الطين النمذجة | في متجر | ||
| مزدوج العصا | |||
| مسحات القطن المسحات | |||
| قوالب البلاستيك ، 10 مم × 10 مم × 5 مم) | Tissue Tek & nbsp ؛ | 4565 | |
| شرائح | |||
| غطاء مختبر | |||
| مسح | كيمبرلي كلارك | 34155 | الوبر الحرة مهمة حساسة مسح |
| Theiler الرسم البياني التدريي | http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf | ||
| Leica SP5X مجهر متحد البؤر | تستخدم Leica | لإجراء التصوير المباشر | |
| حامل Leica DMI 6000 | تستخدم Leica | لإجراء التصوير المباشر | |
| وسط تركيب مائي (إطالة الذهب)مجسات | جزيئية | P36930 | |
| اسم المواد / المعدات | رقم كتالوج الشركة | التعليقات / الوصف | |
| 24 لوحة بئر | Costar | ؛ 3524 | |
| Triton X-100 | Sigma | يستخدم T-8787 | لصنع محلول النفاذية: 0.5٪ Triton X-100 في 1 × مصل |
| الماعز | المستخدم في صنع محلول الحظر: 4٪ مصل الماعز ، 0.1٪ Tween20 في 1x PBS | ||
| Tween20 & nbsp ؛ | سيجما | ص 9416 |
المراجع
- Grosse, A. S., et al. Cell dynamics in fetal intestinal epithelium: implications for intestinal growth and morphogenesis. Development. 138, 4423-4432 (2011).
- Walton, K. D., et al. Hedgehog-responsive mesenchymal clusters direct patterning and emergence of intestinal villi. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15817-15822 (2012).
- Wells, J. M., Melton, D. A. Vertebrate endoderm development. Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 393-410 (1999).
- Hashimoto, H., Ishikawa, H., Kusakabe, M. Development of vascular networks during the morphogenesis of intestinal villi in the fetal mouse. Kaibogaku zasshi Journal of anatomy. 74, 567-576 (1999).
- Mathan, M., Moxey, P. C., Trier, J. S. Morphogenesis of fetal rat duodenal villi. Am J Anat. 146, 73-92 (1976).
- Burns, R. C., et al. Requirement for fibroblast growth factor 10 or fibroblast growth factor receptor 2-IIIb signaling for cecal development in mouse. Dev Biol. 265, 61-74 (2004).
- Pabst, O., Schneider, A., Brand, T., Arnold, H. H. The mouse Nkx2-3 homeodomain gene is expressed in gut mesenchyme during pre- and postnatal mouse development. Dev Dyn. 209, 29-35 (1997).
- Pabst, O., Zweigerdt, R., Arnold, H. H. Targeted disruption of the homeobox transcription factor Nkx2-3 in mice results in postnatal lethality and abnormal development of small intestine. Development. 126, 2215-2225 (1999).
- Kaestner, K. H., Silberg, D. G., Traber, P. G., Schütz, G. The mesenchymal winged helix transcription factor Fkh6 is required for the control of gastrointestinal proliferation and differentiation. Genes & Development. 11, 1583-1595 (1997).
- Madison, B. B., McKenna, L. B., Dolson, D., Epstein, D. J., Kaestner, K. H. FoxF1 and FoxL1 link hedgehog signaling and the control of epithelial proliferation in the developing stomach and intestine. J Biol Chem. 284, 5936-5944 (2009).
- Karlsson, L., Lindahl, P., Heath, J. K., Betsholtz, C. Abnormal gastrointestinal development in PDGF-A and PDGFR-(alpha) deficient mice implicates a novel mesenchymal structure with putative instructive properties in villus morphogenesis. Development. 127, 3457-3466 (2000).
- Mao, J., Kim, B., Rajurkar, M., Shivdasani, R., Mcmahon, A. Hedgehog signaling controls mesenchymal growth in the developing mammalian digestive tract. Development. 137, 1721-1729 (2010).
- Theiler, K. The house mouse. Development and normal stages from fertilization to 4 weeks of age. , 2, Springer-Verlag. (1989).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Mol Cell Biol. 23, 4013-4025 (2003).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants. Science. 277, 1109-1113 (1997).
- Fu, Y. Y., et al. Microtome-free 3-dimensional confocal imaging method for visualization of mouse intestine with subcellular-level resolution. Gastroenterology. 137, 453-465 (2009).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
