Получение высококачественных изображений с помощью просвечивающей электронной микроскопии является сложной задачей, особенно в случае растительных клеток, которые имеют большое количество заполненных водой вакуолей и аэрированных пространств. Тандемная заморозка под высоким давлением и быстрая замена замораживанием значительно сокращают время подготовки образцов растений к ПЭМ, получая образцы с отличной ультраструктурной сохранностью.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Тандем Замораживание высокого давления и резких похолоданий Замена тканей растений для просвечивающей электронной микроскопии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Поскольку электрон передачи 1940s микроскопии (ПЭМ) оказывает биологов с изображениями ультра-высокого разрешения биологических материалов. Тем не менее, из трудоемких и затратных по времени протоколов, которые также требуют опыт в подготовке без артефактов, образцов, ТЕМ не считается методика удобно. Традиционный пробоподготовки для ПЭМ использовали химические фиксаторы, чтобы сохранить клеточные структуры. Замораживание высокого давления является cryofixation биологических образцов при высоких давлениях производить очень быстрые скорости охлаждения, тем самым ограничивая образование льда, который наносит ущерб целостности клеточной ультраструктуры. Замораживание высокого давления и замена замораживания в настоящее время методом выбора для производства самого высокого качества морфологии в секциях смолы для ТЭМ. Эти методы минимизации артефактов, обычно связанные с традиционной обработке для ТЭМ тонких срезов. После cryofixation замерзшей воды в образце жидкости заменяетсяорганический растворитель при низких температурах, этот процесс называется замещение замерзания. Замораживание замена обычно проводят в течение нескольких дней в посвященном, дорогостоящего оборудования. Недавнее нововведение позволяет процесс должен быть завершен в течение трех часов, вместо обычных двух дней. Это, как правило, следует еще несколько дней пробоподготовки, который включает инфильтрацию и встраивания в эпоксидных смол, прежде чем секционирования. Здесь мы приводим протокол, сочетающий замораживание высокого давления и быстрое замещение замораживания, что позволяет образец фиксация завод, чтобы быть достигнуто в течение нескольких часов. Протокол может быть легко адаптирован для работы с другими тканями или организмов. Растительные ткани вызывают особую озабоченность в связи с наличием газированных пространств и заполненных водой вакуолей, которые препятствуют свободной ото льда замерзание воды. Кроме того, процесс химической фиксации особенно долго растений за счет клеточных стенок, препятствующих проникновению химических веществ, чтобы глубоко в ткани. Растительные ткани, следовательно, участнлярно сложным, но этот протокол является надежным и производит образцы высочайшего качества.
Введение
Наше знание ультраструктуры клеток поступает в основном из электронной микроскопии, которые могут решить детали в диапазоне от нескольких нанометров 1. Несмотря на то, настолько мощным, в резолюции ТЭМ не считается удобной, как подготовка образца требуется много времени и трудоемкие протоколы, и требует определенного опыта от врача. Традиционный фиксация образцов объединил использование альдегидов и осмия перед дальнейшей обработки, которая включает обезвоживание, вложение в смоле, а затем секционирования производить ультратонкие срезы, которые затем окрашивали тяжелых металлов. Тем не менее, известно, что химической фиксации может производить артефакты в ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура QFS требует крайней осторожности и осторожности со стороны пользователя, и мы выделить эти меры предосторожности здесь как предупреждения и примечания, где это возможно.
1.Preparation для ФВЧ Run
- Перед началом подготовки образцов, включите морозильник высокого давления в соответствии с инструкциями изготовителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: ФВЧ единица, используемая в данном протоколе является Вольвенд Компактный 02 единица (1А), и это занимает примерно 12:59-и с половиной часов процедуры запуска до ФВЧ работает может начаться.- Включение Вольвенд Компактный 02 высокого давления Freezer.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Результаты, представленные ниже, были получены с использованием Вольвенд Compact 02 для ФВЧ (Рисунок 1A). Одно из главных преимуществ этого инструмента является простота использования образцов носителей и их носителей. При использовании других инструментов, McDonald рекомендует два пользователя должны осуществлять подготовку образцов и ФВЧ, один приготовления образцов, а другой делает замораживание и трансфер в FS криопробирки 9. Тем не менее, Вольвенд образца носители и держатель достаточно .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Успех протокола, представленного здесь в большой степени зависит от пользователя. Во-первых, расширенный подготовка требуется для того, чтобы все необходимые материалы легко доступны и в достаточном количестве, чтобы завершить весь HPF-QFS пробег. Во-вторых, пользователь должен работать быстро, переход от стадии-к-шагом в эффективной манере, что сводит к минимуму обращение с пробами, таким образом минимизируя изменения в нативном состоянии ткани. После того, как образцы замораживаются и, прежде чем они обезвожены крайне.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Доброта и щедрость доктора Кента Макдональд из Калифорнийского университета в Беркли, получают высокую оценку. Мы благодарим анонимного рецензента за очень полезные советы. Лаборатория Burch-Смит поддерживается стартовые средства из Университета Теннесси.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Wohlwend HPF Compact 02 Морозильная машина высокого давления | Technotrade International, Inc | HPF02 | Со встроенным осциллографом для отображения кривых замерзания и давления; Для отображения требуется ПК (не входит в комплект); параметров замораживания |
| Держатель для носителей алюминия DN 3 x 0,5 мм | Technotrade International, Inc | 290 | |
| Держатели образцов, P=1 000, DN 3 x 0,5 алюминия, тип A | Technotrade International, Inc | 241-200 | |
| Держатели образцов, P=1 000, DN 3 x 0,5 алюминия, тип B | Technotrade International, Inc | 242-200 | |
| Storage Dewar 20,5 л, MVE Millennium 2000 XC20 | Таблица | ||
| Пекарские дрожжи | Чем старше, тем лучше, чтобы избежать чрезмерного газообразования (CO2) | ||
| Зубочистки | |||
| Регистратор данных термопары EL-USB-TC | OMEGA Engineering Inc. | OM-EL-USB-TC | Запасной аккумулятор приобретается отдельно |
| Температурный зонд | Электронная микроскопия Sciences | 34505 | |
| Нагревательный блок 12/13 мм | |||
| Вращающийся шейкер | Fisher Scientific | 11-402-10 | |
| Листовой пробивщик - Harris Uni-core 2.00 | Ted-Pella Inc. | 15076 | |
| Розовый стоматологический воск | Электронная микроскопия | Науки 72660 | |
| Криогенные флаконы 2 мл | Электронная микроскопия Науки | 61802-02 | |
| Метанол | |||
| Фен | |||
| Сухой лед | |||
| Жидкий азот | |||
| Ацетон | |||
| Щипцы | Несколько пар |
Ссылки
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and cell biology. 130, 877-889 (2008).
- Studer, D., Hennecke, H., Muller, M.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
