Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Измерение потоков минеральных питательных веществ и токсикантов в растениях с помощью радиоактивной метки

11.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51877

⸱

22 августа 2014 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Toronto

В этой статье

Краткое содержание

В растениях измерение потоков питательных веществ и токсикантов имеет важное значение для изучения питания растений и токсичности. В этой статье мы рассмотрим протоколы радиоиндикаторов для определения притока и оттока в корнях неповрежденных растений на примере потоков калия (K+) и аммиака/аммония (NH3/NH4+). Обсуждаются преимущества и ограничения таких методик.

Аннотация

Однонаправленный приток и отток питательных веществ и токсикантов, и их результирующие чистые потоки, занимают центральное место в питании и токсикологии растений. Радиоизотопное отслеживание является основным методом, используемым для измерения таких потоков как внутри растений, так и между растениями и окружающей их средой. Данные о потоках, полученные с помощью протоколов радиоактивных индикаторов, могут помочь выяснить емкость, механизм, регуляцию и энергетику транспортных систем для конкретных минеральных питательных веществ или токсикантов, а также могут дать представление о компартментировании и скорости оборота субклеточных минеральных и метаболитных пулов. В этой статье мы опишем два основных радиоизотопных протокола, используемых в биологии растений: прямой приток (DI) и компартментный анализ по оттоку индикаторов (CATE). Основное внимание уделяется измерению потока калия (K+) в качестве питательного вещества и аммиака/аммония (NH3/NH4+) в качестве токсиканта в неповрежденных проростках модельного вида ячменя (Hordeum vulgare L.). Эти протоколы могут быть легко адаптированы к другим экспериментальным системам (например, к другим видам, вырезанному растительному материалу и другим питательным веществам/токсикантам). Обсуждаются преимущества и ограничения этих протоколов.

Введение

Поглощение и распределение питательных веществ и токсикантов сильно влияют на рост растений. Соответственно, исследование основных транспортных процессов является одним из основных область исследований в биологии растений и сельскохозяйственных наук 1,2, особенно в контекстах питательной оптимизации и экологических стрессов (например, соль стресс, токсичность аммония). Главным среди методов для измерения потоков в растениях является использование радиоизотопных индикаторов, которая была разработана значительно в 1950 (смотри, например, 3) и продолжает быть широко используется сегодня. Другие методы, такие как измерения истощение питательных веществ из корневой среды и / или накопления в тканях, использование ионно-селективных вибрирующих микроэлектродов, такие как MIFE (микроэлектродной ионный оценки потока) и SIET (сканирование ионоселективная техники электрод), и использования ион-селективный флуоресцентные красители, также широко применяется, но ограничены в их способности обнаружить чистую гриппаРЭС (т.е. разница между притоком и оттоком). Использование радиоизотопов, с другой стороны, позволяет исследователю уникальную возможность изолировать и количественно однонаправленные потоки, которые могут быть использованы для решения кинетических параметров (например, К М и V макс), и дать представление о мощности, энергетика, механизмы и регулирование, транспортных систем. Однонаправленные измерения потока, сделанные с радиоактивных индикаторов являются особенно полезными в условиях, когда поток в противоположном направлении высока, а оборот внутриклеточных пулов происходит быстро 4. Кроме того, радиоиндикаторные методы позволяют измерять, которые будут проводиться в довольно высоких концентрациях субстрата, в отличие от многих других методов (см 'Обсуждение', ниже), так как прослеживается изотоп наблюдается на фоне другого изотопа того же элемента.

Здесь мы предоставляем подробные инструкции для радиоизотопного измерения однонаправленной и пET потоки минеральных питательных веществ и токсикантов в целые растения. Акцент будет сделан на измерении потока калия (K +), растительного макро- 5 и аммиака / аммония (NH 3 / NH 4 +), другой макроэлементов, которые, однако, токсичным, когда он присутствует в высоких концентрациях (например, 1- 10 мМ) 2. Мы будем использовать радиоизотопы 42 K + (т 1/2 = 12,36 ч) и 13 NH 3/13 NH 4 + (т 1/2 = 9,98 мин), соответственно, в неповрежденных саженцев модель системы ячменя (Hordeum обыкновенной L .), в описании двух основных протоколов: прямой приток (DI) и полигамное анализа индикаторного оттока (CATE). Отметим, с самого начала, что эта статья просто описывает шаги, необходимые для выполнения каждого протокола. Где это уместно, краткие пояснения расчетов и теории предоставляются, но подробные экспозиции каждой техники'Ы фона и теория может быть найден в нескольких ключевых статей на эту тему 4,6-9. Важно отметить, что эти протоколы в целом подлежит передаче потока анализ других питательных веществ / токсикантов (например, Na +, 24, 22 Na +, Rb + 86, 13 NO 3 -) и других видов растений, хотя и с некоторыми оговорками (смотри ниже) . Мы также подчеркиваем важность того, чтобы все исследователи, работающие с радиоактивными материалами должны работать в соответствии с лицензией, расположенной через ионизирующего регулятора радиационной безопасности их учреждения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1 завод Культура и подготовка

  1. Вырастить ячменя гидропонике в течение 7 дней в камере роста климат-контролем (подробнее см 10).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно рассмотреть вопрос об изучении растений на различных стадиях развития, как питательные требования будут меняться с возрастом.
  2. За день до экспериментов, расслоение несколько саженцев вместе, чтобы сделать единый копировщика (3 растения в пачку для DI, 6 заводов в пачку для ЗАТО). Bundle саженцы, обернув 2-см кусок Tygon трубки вокруг базальной части побегов, и обеспечение трубку с лентой, чтобы создать "воротник".
    ПРИМЕЧАНИЕ: Число растений в пачке может изменяться в зависимости от условий эксперимента 10,13,14. Комплектация делается для улучшения статистики и точность измерения, особенно когда корневой массы и / или удельная активность низкая.

2 Получение экспериментальных решений / Материалы

Содержание "> Примечание: В следующем обычно выполняется за 1 день до эксперимента.

  1. Для DI, собрать следующее: Pre-маркировки, этикетирования и десорбции решения (подробнее см 11), центрифугирования труб (для спин-сушки образцов растений), и ампулами (для растительного материала и удельной активности [S °; смотри ниже]). Аэрацию и смешать все решения.
  2. Для ЗАТО, собрать следующие: Хорошо смешанная, газобетон маркировки и элюирования решения (подробнее см 10), эффлюксных воронки, центрифугирования труб (для спин-сушки образцов растений) и примеров флаконов (для элюатов, образцы растений, и определение S о и коэффициент разбавления [D F; ниже]).

3 Подготовьте радиоиндикаторные

ВНИМАНИЕ: Следующие шаги безопасности должны быть приняты до начала работы с радиоактивностью.

  1. Убедитесь, что требования радиоакный материалы лицензия понимаются и последовал. Надевайте оборудование для обеспечения безопасности (т.е., очки, перчатки, лабораторный халат, свинец жилет / воротник) и дозиметры (например, TLD кольцо и значок). Настройка защиты (т.е., оргстекло и свинцовые кирпичи) и выполнять радиоактивный работу за ним. Убедитесь, что счетчик Гейгера-Мюллера присутствует для того, чтобы регулярно контролировать на предмет загрязнения.
  2. Подготовка 42 K +
    1. Поместите чистую, сухую мензурку на баланс. Нулевой баланс.
    2. Удалить пузырек индикатора (20 мКи 42 K 2 CO 3, в виде порошка) из упаковки и залить трассирующими в стакан. Обратите внимание на массы.
    3. Внесите 19,93 мл дН 2 O, а затем 0,07 мл H 2 SO 4, в стакан. Это будет стимулировать следующую химическую реакцию:
      42 K 2 CO 3 (Ы) + H 2 SO 4 (L) + H 2 O (L) → 42 K 2 SO 4 (Л) + CO 2 (V) + 2H 2 O (л)
    4. Рассчитайте концентрацию радиоактивного раствора, учитывая массу и молекулярную массу K 2 CO 3, и объем (20 мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с 13 NH 3/13 NH 4 + трассирующими производится в циклотроне через протонного облучения атома кислорода воды (как правило, в результате 100-200 мКи деятельности; для производства деталей, увидеть 12). Поскольку количество 14 NH 3/14 NH 4 + чрезвычайно низка в этих растворах, концентрация Н из маточного раствора можно пренебречь.

4 Прямая Приток (DI) Измерение

  1. Для 42 K +, пипетки количество радиоактивного раствора, необходимое для достижения желаемого конечного концентрацию K + в маркировке решения.
    1. Для 13 NH 3/13 NH 4 +, пипетку небольшое количество (<0,5 мл) в растворе маркировки. Разрешить маркировки решение тщательно перемешать (через аэрации).
  2. Пипетки 1 мл подвыборки маркировки раствора в пробирку образца и повторить три раза (4 образцы в общей сложности).
    1. Измерьте радиоактивности во флаконах (в "импульсов в минуту", CPM), с помощью гамма-счетчика. Убедитесь, что счетчик запрограммирован таким образом, что качения показания корректируются для изотопного распада (это особенно важно для таких короткоживущих индикаторов).
    2. Рассчитать С О (в виде копий в минуту мкмоль -1) путем усреднения подсчеты четырех образцов (CPM мл -1) и деления на концентрации субстрата в растворе (мкмоль мл -1).
  3. Погрузите корни в предварительно маркировки (нерадиоактивного) решения в течение 5 мин, предварительно уравновесить растений в условиях испытаний (смнапример, 10,13,14 для изменения во времени предварительно этикетки).
  4. Погрузите корни в маркировке (радиоактивного) решения в течение 5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: раз Маркировка может меняться в зависимости от эксперимента 3,4,7-10.
  5. Трансфер корни десорбции решения в течение 5 сек, чтобы удалить большую часть поверхности-придерживаясь радиоактивности. Передача корни во второй стакан десорбирующего раствора в течение 5 мин и далее четких корней внеклеточного индикатора.
  6. Проанализируйте и отдельные побеги, прикорневых побегов, и корни.
  7. Поместите корни в центрифужные пробирки и образцы спина в течение 30 сек в низкой скорости, клинико-класса центрифуги (~ 5000 XG) для удаления поверхностных и иловой воды.
  8. Взвесьте корни (сырого веса, FW).
  9. Количество радиоактивности в пробах растений (стрелять, базального побега, и корня, см шаг 4.2.1).
  10. Вычислить поток. Рассчитать приток в растение по формуле
    Φ = Q * / S о мас L
    где Φ является поток(Мкмоль г -1 ч -1), Q * является количество примеси накапливаются в ткани (копий в минуту, как правило, в корне, стрелять, и базальная стрелять, комбинированные), S о является удельная активность маркировки решения (CPM мкмоль - 1), W есть корень свежий вес (г), а T L это время маркировка (HR).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более сложные вычисления можно сделать для учета одновременного индикаторного истечения от корней во время маркировки и десорбции, на основе параметров, полученных из ЗАТО (см ниже; подробнее см 4).

5 полигамное Анализ Tracer отток (CATE) измерения

  1. Приготовьте раствор маркировки и мера S о (см шаги 4,1 - 4,2, выше).
  2. Измерьте коэффициент разбавления (D F).
    Примечание: Часто, положение образца относительно детектора в гамма-счетчике может влиять на количествоизлучения измеряется. Смотреть обсуждение для деталей.
    1. После измерения С О, добавить 19 мл H 2 O к каждому образцу (таким образом, чтобы конечный объем = элюат объем = 20 мл). Количество радиоактивности в каждой пробе 20 мл (этап 4.2.1).
    2. Расчет D F делением средней СРМ в 1-мл образцы средним импульсов в минуту на 20-мл пробы.
  3. Погружают корни в маркировке раствора в течение 1 часа.
  4. Удалить растения от решения маркировки и передачи растений отток воронку, обеспечивая весь корень материал в воронку. Мягко безопасные растения в стороне оттока воронку, применяя небольшую полоску ленты на пластиковой втулкой.
  5. Аккуратно вылейте первый элюат в воронку. Включить таймер (подсчитывая).
  6. Откройте кран и соберите элюат в пробирку образца после 15 сек (примечание: время элюирования будет меняться, смотрите ниже). Закройте кран. Аккуратно влить следующий элюата в воронку.
  7. RepeaT шаг 5,6 в течение оставшейся части серии элюции, которое следует ниже, от первого до конечного элюата: 15 сек (четыре раза), 20 сек (три раза), 30 сек (дважды), 40 секунд (один раз), 50 секунд (один раз), 1 мин (в 25 раз), на общую элюции периода 29,5 мин
    ПРИМЕЧАНИЕ: десорбция серии может меняться в зависимости от условий эксперимента 7-10,13,14.
  8. После того, как протокол элюирование завершена, урожай растений (шаги 4,6 - 4,8, выше).
  9. Количество радиоактивности в элюатов и растительных образцов в гамма-счетчике (умножения гороскоп для каждого элюата путем D F, см 5,2).
  10. Участок Tracer выпуск (CPM г (кубический FW) -1 мин -1) в виде функции времени элюирования. Для стационарных условиях, выполнять линейные регрессии и расчеты потоков, период полураспада валют и размеры пула (подробнее см 6-9).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 показаны изотермы найденные с помощью техники DI (с 13 N), для притока NH 3 в корни интактных проростков ячменя, выращенных при высокой (10 мМ) NH 4 +, и либо низкий (0,02 мм) или высокой (5 мМ ) K +. Изотермы отображения Михаэлис-Ментен кинетики, когда NH 3 флюсы строится как функция внешнего NH 3 концентрации ([NH 3] доб; скорректированной на изменения в рН раствора 13). NH 3 пото...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Как показано в приведенных выше примерах, метод радиотрейсера является мощным средством измерения однонаправленных потоков питательных веществ и токсикантов в Планта. Рисунок 1 показывает, что NH 3 приток может достигать свыше 225 мкмоль г -1 ч -1, которая является, пожалуй, высокая Bona поток ФИДЕ трансмембранный не сообщалось в системе растений 13, но величина этого потока не было бы видно, если только чистые потоки были измерены. ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Советом по естественным наукам и инженерии Канады (NSERC), программой Канадской исследовательской кафедры (CRC) и Канадским фондом инноваций (CFI).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Гамма-счетчикPerkin ElmerМодель: Wallac 1480 Wizard 3"
Geiger-Mü ller counterLudlum Measurement Inc.Модель 3 Обзорный измеритель
400 мл Стеклянные стаканыVWR89000-206Для решений для предварительной абсорбции, абсорбции и десорбции
Стеклянная воронкаVWR89000-466Для отточной воронки
Большие трубкиVWR529297Для отточной воронки
Средние трубкиVWR684783Для связывания
Малые трубкиVWR63013-541Для
аэрации Аэрационный коллекторPenn Plax Air Techчан 5.5Для контроля/распределения сжатого воздуха по растворам
Стеклянные сцинтилляционные флаконыVWR66022-128Для подсчета гамма
Стеклянные центрифужные пробиркиVWR47729-576Для образцов корней с отжимом и сушкой
KimwipesVWR470173-504Для образцов корней с отжимной сушкой
Ножницы для препарированияVWR470001-828
ЩипцыVWR470005-496
Низкоскоростная клиническая центрифугаInternational Equipment Co.76466M-4Для отжимной сушки образцов корней
пипетка1 мл GilsonF144493
пипетка 10 млGilsonF144494
1 мл пипеткаVWR89079-470
Пипетка 10 мл VWR89087-532
Аналитические весыMettler toledoPB403-S/FACT

Ссылки

  1. Kronzucker, H. J., Coskun, D., Schulze, L. M., Wong, J. R., Britto, D. T. Sodium as nutrient and toxicant. Plant Soil. 369, 1-23 (2013).
  2. Britto, D. T., Kronzucker, H. J. NH4+ toxicity in higher plants: a critical review. J. Plant Physiol. 159, 567-584 (2002).
  3. Epstein, E. Mechanism of ion absorption by roots. Nature. 171, 83-84 (1953).
  4. Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Can unidirectional influx be measured in higher plants? A mathematical approach using parameters from efflux analysis. New Phytol. 150, 37-47 (2001).
  5. Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Cellular mechanisms of potassium transport in plants. Physiol. Plant. 133, 637-650 (2008).
  6. Walker, N. A., Pitman, M. G. Measurement of fluxes across membranes. Encyclopedia of plant physiology. Lüttge, U., >Pitman, M. .G. 2 Part A, Springer. Berlin. (1976).
  7. Kronzucker, H. J., Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M. Analysis of 13NH4+ efflux in spruce roots - A test case for phase identification in compartmental analysis. Plant Physiol. 109, 481-490 (1995).
  8. Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M., Ruth, T. J. Studies of the uptake of nitrate in barley. 3. Compartmentation of NO3-. J. Exp. Bot. 42, 1455-1463 (1991).
  9. Lee, R. B., Clarkson, D. T. Nitrogen-13 studies of nitrate fluxes in barley roots. 1. Compartmental analysis from measurements of 13N efflux. J. Exp. Bot. 37, 1753-1767 (1986).
  10. Coskun, D., Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Regulation and mechanism of potassium release from barley roots: an in planta 42K+ analysis. New Phytol. 188, 1028-1038 (2010).
  11. Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Fluxes measurements of cations using radioactive tracers. Plant Mineral Nutrients: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Maathuis, F. .J. .M. ., Volume 953, Springer. 161-170 (2013).
  12. Meeks, J. C. 13N techniques. Nitrogen isotope techniques. Knowles, R. ,, Blackburn, T. .H. , Academic Press. 273-303 (1993).
  13. Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Becker, A., Kronzucker, H. J. Rapid ammonia gas transport accounts for futile transmembrane cycling under NH3/NH4+ toxicity in plant roots. Plant Physiol. 163, 1859-1867 (2013).
  14. Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Oh, S., Kronzucker, H. J. Capacity and plasticity of potassium channels and high-affinity transporters in roots of barley and Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).
  15. Johansson, I., et al. External K+ modulates the activity of the Arabidopsis potassium channel SKOR via an unusual mechanism. Plant J. 46, 269-281 (2006).
  16. Nocito, F. F., Sacchi, G. A., Cocucci, M. Membrane depolarization induces K+ efflux from subapical maize root segments. New Phytol. 154, 45-51 (2002).
  17. Wang, M. Y., Glass, A. D. M., Shaff, J. E., Kochian, L. V. Ammonium uptake by rice roots. 3. Electrophysiology. Plant Physiol. 104, 899-906 (1994).
  18. Walker, D. J., Leigh, R. A., Miller, A. J. Potassium homeostasis in vacuolate plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10510-10514 (1996).
  19. Holm, L. M., et al. NH3 and NH4+ permeability in aquaporin-expressing Xenopus oocytes. Pflugers Archiv. Eur. J. Physiol. 450, 415-428 (2005).
  20. Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Trans-stimulation of 13NH4+ efflux provides evidence for the cytosolic origin of tracer in the compartmental analysis of barley roots. Funct. Plant Biol. 30, 1233-1238 (2003).
  21. Malagoli, P., Britto, D. T., Schulze, L. M., Kronzucker, H. J. Futile Na+ cycling at the root plasma membrane in rice (Oryza sativa L.): kinetics, energetics, and relationship to salinity tolerance. J. Exp. Bot. 59, 4109-4117 (2008).
  22. Kronzucker, H. J., Britto, D. T. Sodium transport in plants: a critical review. New Phytol. 189, 54-81 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Однонаправленный потокпрямой притоккомпартментальный анализкалий-42азот-13проростки ячменягидропонная культурагамма-счетчикизмерение потока
Измерение потоков минеральных питательных веществ и токсикантов в растениях с помощью радиоактивной метки
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.