Мы представляем в пробирке мыши плода систему культуры эритробласт печени, что рассекает ранние и поздние этапы терминала эритропоэза. Эта система облегчает функциональный анализ специфических генов в разных стадиях развития.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Мышь фетальной печени Культура Система рассекать гена-мишени Функции на ранних и поздних стадиях терминала эритропоэза
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Эритропоэз включает динамический процесс, который начинается с решимости эритроидная пакетных единиц (БОЕ-ES) с последующим быстро делящиеся эритроидного колониеобразующих единиц (КОЕ-ES). После КОЕ-Эс, клетки морфологически узнаваемым и обычно называют терминальные эритробласты. Одна из проблем для изучения терминала эритропоэза является отсутствие экспериментальных подходов рассекать функций генов в хронологическом порядке. В этом протоколе, мы описываем уникальную стратегию, чтобы определить функции генов в ранних и поздних стадиях терминального эритропоэза. В этой системе, мышь плода Ter119 печени (маркер зрелых эритроидных клеток) отрицательные эритробластов очищали и трансдуцированных экзогенной экспрессии кДНК или малых РНК шпильки (shRNAs) для интересующих генов. Затем клетки культивировали в среде, содержащей факторы роста других, чем эритропоэтин (ЕРО), чтобы поддерживать их предшественников этап в течение 12 часов, позволяя экзогенные кДНК или shRNAsвыразить. Клетки были изменены на Epo среды после 12 часов, чтобы индуцировать дифференцировку и пролиферацию клеток, а экзогенные генетические материалы были уже выражены. Этот протокол облегчает анализ генных функций в ранней стадии терминального эритропоэза. Для изучения поздно терминала эритропоэз стадии, клетки немедленно культивировали в Эпо среду после трансдукции. Таким образом, эти клетки уже дифференцированы в поздней стадии эритропоэза терминала, когда были выражены трансдуцированных генетические материалы. Мы рекомендуем общее применение этой стратегии, которая помогла бы понять подробные функций генов в различных стадиях терминала эритропоэза.
Введение
Эритропоэза является процесс дифференциации мультипотентных гемопоэтических стволовых клеток в зрелые эритроциты. Это поэтапный процесс включает в себя формирование привержены эритроидная пакетных единиц (БОЕ-ES), быстро делящиеся эритроидные колониеобразующих единиц (КОЕ-Эс), и морфологически распознаваемых эритробластов 1,2. Терминал эритропоэз из клеток-предшественников CFU-E включает в себя последовательную эритропоэтин-зависимые и независимые этапы 2,3. На ранней стадии терминального эритропоэза, эритропоэтин (ЕРО) связывается со своим рецептором на поверхности клетки и индуцирует серию последующих сигнальных путей, которые предотвращают ап....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Эксперименты, описанные в этом протоколе были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Северо-Западного университета Уходу за животными и использованию комитета.
1 Получение культуральной среде
- Подготовьте фибронектина решение. Добавить 1 мл воды на одну ампулу человеческого фибронектина (1 мг). Оставьте раствор в капот культуры ткани в течение 30 мин без перемешивания. Передача общий объем жидкости в 50 мл PBS, чтобы получить конечную концентрацию 20 мкг / мл, и осторожно перемешать также. Сделать фибронектин раствор свежей перед нанесением на пластину (смотри ниже).
- Подготовьте ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунок 1 описывает экспериментальные стратегии. Протокол состоит из двух независимых условий для таргетинга функции сигнальных молекул в ранних и поздних стадиях терминального эритропоэза. Ter119 отрицательные плода эритробласты печени были очищены от E13.5 мыши плода. Проточной цитометрии анализ плода эритроидных клеток печени до и после очистки показали, что очистка была эффективна (Фигуры 2А и 2В). Для ранней стадии терминала эритропоэза (фиг.1 пунк.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы представляем уникальную систему, чтобы хронологически проанализировать мыши плода терминала печени эритропоэз. За счет применения различных условиях культивирования, мы успешно расчлененный терминала эритропоэз в ранних и поздних стадиях. Это особенно важно, чтобы определить механизмы генов с множеством функций. Например, Rac GTPases играют важную роль в различных стадиях терминала эритропоэза. Торможение Rac GTPases в ранней стадии дифференциации терминал влияет эритропоэз и пролиферации клеток. С другой сторо.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Благодарности
Это исследование было поддержано NIH R00HL102154, и Американского общества гематологии ученого премии в P Джи.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Модифицированная среда Дульбекко от IscoveIMDM (IMDM) | Gibco | 12440-053 | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | GEMINI Bio-product | 700-102P | |
| Раствор пенициллин-стрептомицина | Гиклон | SV30010 | 100x |
| L-глутамин | Гиклон | SH30034,01 | 200 мМ |
| Мышиный FIT3 лиганд (Flt-3L) | BD Biosciences | 14-8001-80 | |
| Мышиный рекомбинантный интерлейкин-6 (ИЛ-6) | GEMINI Bio-product | 300-327P | |
| Фибронектин | BD Biosciences | ||
| Бычья сыворотка альбумин (BSA) | STEMCELL TECH | 9300 | 10% запас в IMDM |
| Erythropoietin(Epo) | PROCRIT | NOC 59676-303-00 | 3,000 Ед/мл запас |
| частиц стрептавидина плюс | BD Pharmingen | 557812 | |
| EasySep Magnet | STEMCELL TECH | 18000 | |
| Полипропиленовая трубка с круглым дном, 5 мл | FALCON |
Ссылки
- Hattangadi, S. M., Wong, P., Zhang, L., Flygare, J., Lodish, H. F. From stem cell to red cell: regulation of erythropoiesis at multiple levels by multiple proteins, RNAs, and chromatin modifications. Blood. 118 (24), 6258-6268 (2011).
- Richmond, T. D., Chohan, M., Barber, D. L.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
