Preparación de sináptica Membrana plasmática y proteínas postsináptica densidad utilizando un gradiente discontinuo de sacarosa

Resumen

Este artículo detalla el enriquecimiento de las proteínas asociadas con la membrana plasmática sináptica por ultracentrifugación en un gradiente discontinuo de sacarosa. También se describe la preparación posterior de las proteínas de densidad post-sináptica. Preparaciones de proteínas son adecuados para el Western Blot o análisis DIGE 2D.

Resumen

Técnicas de fraccionamiento subcelular neuronales permiten la cuantificación de proteínas que son objeto de trata hacia y desde la sinapsis. Como se describió originalmente en la década de 1960, las proteínas asociadas con la membrana plasmática sináptica se pueden aislar mediante ultracentrifugación en un gradiente de densidad de sacarosa. Una vez que se aislaron las membranas sinápticas, el complejo macromolecular conocido como la densidad post-sináptica puede ser posteriormente aislado debido a su insolubilidad detergente. Las técnicas usadas para aislar las membranas plasmáticas sinápticas y proteínas de densidad post-sinápticas siguen siendo esencialmente la misma después de 40 años, y se utilizan ampliamente en la investigación neurocientífica actual. Este artículo detalla el fraccionamiento de las proteínas asociadas con la membrana plasmática sináptica y post-sináptica densidad utilizando un gradiente discontinuo de sacarosa. Preparaciones de proteínas resultantes son adecuadas para el Western Blot o análisis DIGE 2D.

Introducción

Las neuronas se comunican a través de las sinapsis, y la calidad de esta comunicación está regulada en gran medida por las alteraciones en la composición de las proteínas en la sinapsis. En particular, las proteínas localizadas en la densidad post-sináptica participan en la comunicación neuronal por receptores de neurotransmisores íntimamente andamiaje con sus sistemas de transducción de señales ^1. Además, los cambios duraderos en la fuerza de la eficacia sináptica son controlados por la adición o eliminación de los receptores a la densidad post-sináptica ^1-6. Por lo tanto, el aislamiento y la cuantificación de las proteínas sinápticas es una té....

Protocolo

El siguiente protocolo se ajusta a las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado Animal y ha sido aprobado por la Facultad de Medicina y del Comité de Cuidado de Animales de Farmacia de la Universidad de Toronto.

1. Preparar Obligatorio reactivos como se indica en la Tabla 1

1. Añadir proteasa y fosfatasa (si es necesario) inhibidores a todas las soluciones de sacarosa, tampones y _ddH2O a concentraciones descritas en la Tabla 1. IMPORTANTE: Realice todos los pasos a 4 ° C y pre-cool todos los reactivos y equipos antes del inicio del experimento. Etiquetar todos los tubos, incluyendo tubos de ultrace....

Resultados

La preparación del gradiente de densidad de sacarosa debe dar lugar a una clara separación de las tres soluciones molares de sacarosa (0,8, 1,0, y 1,2 M de sacarosa). Véase la Figura 3A para un ejemplo del gradiente antes de añadir la muestra de proteína. Si el gradiente se prepara con demasiada antelación, o si se prepara en una superficie de la mesa con la vibración de otro equipo, el gradiente se verá comprometida y no se logra una separación adecuada. Si una clara separación de las tres soluciones n.......

Discusión

Hay varios pasos en el proceso que son críticos para un resultado exitoso. En el paso 3, es importante que un grado consistente de homogeneización se logra para cada muestra. Cuando la homogeneización de tejido con el homogeneizador accionado por motor, una velocidad constante se utiliza no sólo para la rotación de la mano del mortero, pero también con el número de golpes. El tiempo de incubación durante el choque osmótico debe ser preciso, ya que la homogeneización ampliada o de la incubación en la solución hipotónica .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1 M HEPES, pH 7.4	BioShop	HEP003.100
HEPES	BioShop	HEP001.500
Sacarosa	BioShop	SUC507.1
EDTA	BioBasic	EB0185
PMSF	BioShop	PMS123.5
Aprotinina	BioShop	APR600.1
Leupeptina	BioShop	LEU001.1
Pepstatin	BioShop	PEP605.5
Benzamidina	BioShop	BEN601.25
Fluoruro de sodio	BioShop	SFL001.100
Pirofosfato de sodio	BioShop	SPP310.100
Ortovanadato de sodio	BioShop	SOV664.10
β-glicerofosfato	BioShop	GYP001.10
Triton X-100	BioShop	TRX506.500
18 G x 1 & frac12; ” aguja	BD	305196
jeringa de 1 cc	BD	309659
Vidrio Homogeneizador de teflón Kontes Duall 23	VWR	KT885450-0023
IKA Modelo RW 16 agitador básico	IKA Works	2572100
Sorvall SM-24 rotor de ángulo fijo	ThermoScientific	29017
Centrífuga Sorvall RC 6 Plus	ThermoScientific	46910
Tubos de polialómero de pared fina (13,2 ml)	Beckman Coulter	331372
SW 41 Ti		Beckman Coulter
Beckman L-80	Beckman Coulter
Tubos de policarbonato de tajo grueso (3,5 ml)
TLA-100.3	Ultracentrífuga de sobremesa Beckman Coulter	349481
Beckman TL-100	Beckman Coulter

Cuchara basculante de rotor Ultracentrífuga de suelo 331362 Rotor de ángulo fijo Beckman Coulter 349622