morphant 배아를 생성하는 방법은 발달 메커니즘과 유전자 규제 네트워크를 연구하는 것이 필수적이다. 바다 스타 Patiria miniata는 이러한 연구에 대한 새로운 모델 시스템입니다. 여기서 우리는 배아의 문화를, 배우자를 얻기 생산을위한 프로토콜,이 종 접합자의 빠른 미세 주입을 제시한다.
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이 논문에서
요약
초록
극피 동물은 긴 유전자 조절 및 개발 프로세스의 진화의 연구를 위해 최근 재생 및 개발 연구에 좋아하는 모델 시스템되어하고있다. 바다 스타, Patiria miniata는 이전에 성게, Strongylocentrotus의 purpuratus 및 Lytechinus의 variegatus에 거의 독점적으로 수행 된 이러한 유형의 연구를위한 모델 시스템으로 유행을 얻고있다. 이러한 모델 시스템의 장점은 어떤 특정 유전자, 또는 하향 조절 최대 인 셀 그룹 라벨링, 또는 리포터 유전자 도입 배아 변경됨 제조 용이성이다. 단일 마이크로 인젝션 법은 변형 된 배아의 다양한을 생성 할 수있다. 여기서는 P.에서 생식 세포를 얻기위한 방법을 제시 miniata,이 배아를 생산하고, 미세 주입을 통해가 혼란 시약을 도입. 건강 morphant 배아는 이후 GE의 양적 및 질적 연구에 고립 아르네브라스카 기능. 이 유기체의 게놈 및 사체 데이터의 가용성을 수행하고이를 실행의 용이성되는 연구의 종류가 증가하고있다.
서론
(일반적으로 박쥐 스타로 알려진) 바다 스타, Patiria miniata는 6-8 진화 4,5 발달 세포 1 세의 다양한, 그리고 생태 학적 연구 9 11에 대한 재미 있고 다양한 모델 시스템으로 부상하고있다. 성인 P. miniata 바하 캘리포니아 12 싯카, 알래스카의 태평양 해안을 따라 분포하고 쉽게 해양 수족관에서 유지됩니다. 난 모세포를 얻을 연중 각 여성 수십 계란의 수천을 흘리다 수 있습니다. 난 모세포 쉽게 성숙 외부 13 기름지게한다. 생성 된 배아는 쉽게 관찰을 가능하게 투명; 그들은 기적으로 개발하고, 개발을 위해 만들어진 프로그램 만 바다 물을 필요로합니다. 전체 게놈 조립 및 여러 transcriptomes도 P. 사용할 수 있습니다 miniata ( Echinobase.org ). 이러한 장점은 연구의 범위에 이상적및 교육 목적.
최근, P. miniata 발달 유전자 규제 네트워크에 대한 모델 시스템은 14 - 1....
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프로토콜
수있는 한 15 ° C에서 모든 바다 물 또는 인공 해수 (SW), 성인 동물, 그리고 문화를 유지합니다. 확인 계란 접합자는 SW에 몰입 보관됩니다.
증류수 또는 역삼 투 물로 재구성 상업적으로 제조 된 바다 소금 SW의 소스로도 제공합니다. 비중계를 사용하여 염분을 확인하고 최적의 수준을 달성하기 위해 염 또는 물을 조정합니다. 1.020-1.025 사이의 비중 수준을 유지합니다. 모든 유리를 유지하고 plasticware에 화학 물질과 모든 오염을 방지하기 위해 모든 다른 실험 실용에서 분리합니다. 탈 물이나 물에 여러 번 세척 한 다음 묽은 차아 염소산 나트륨에 가끔 몸을 담근 채 수세에 의해 청소 배아 학년 실험 실용.
Patiria의 miniata 성인에서 1 얻기 및 성숙 배우자
- 생식선을 절제하는 동물을 선택합니다. 난소 또는 고환의 존재를보고 절제 후 섹스를 결정 P. 때문에 miniata는 자체 아니다xually 동종 이형.
- 메스 블레이드 (그림 1A)와 바다 별 암의 측면을 따라 1cm보다 크지 않은 작은 구멍을, 잘라. 작은 무딘 종단 집게 다시 절개의 ....
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결과
이 프로토콜의 목적은 배아에 시약을 소개하는 것입니다. 우리는 녹색 형광 단백질 (GFP)의 발현을 구동하는 DNA 리포터 구조체를 주입하여 프로토콜의 효과를 보여준다. DNA가 초기 절단시 통합으로 주입 된 배아는 클론 패치 (그림 4A-B)에서 GFP를 표현한다. 배아에 도입하는 것이 바람직하다 많은 시약은 높은 수량 및 배아의 최적 배치에 독성이다. 개발 지연 수정란 단계 초기 절단 또는에서 발전을 체포하여 독성 매니페스트 또는 비정상적인 개발 (그림 5A-C)를 부과하여.
P.에서 그림 1 얻기 배우자 miniata
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토론
이 기술의 초보 사용자 어렵지만 성공적으로 morphant 배아를 만들기위한 필수적인 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 성숙하고 적절하게 비옥 것이다 건강한 난자를 선택하는 것입니다. 배양 정상적인 발달의 비율이 계절에 따라, 동물의 건강과 난자들이 단일 개별에서 수확 된 횟수. 난 모세포 월 ~ 10 년 4 ~ 더 나은 품질의 경향이있다. 그것은 대부분의 그림 2A보다는 그림 2B처럼 수 있도록 진행하기 전에 난자을주의 깊게 보는 것이 중요하다. 그것은 그들이 난자가 처리 될 때 필터링하기에 충분히 작은 경우 특히 성숙되지 모세포의 수가 적은하도록 허용된다. 때때로, 미개발 난자의 성숙을위한 준비가 완벽하게 개발 된 난자만큼이나 크다. 그들은 그들의 거친 갈색 colorin의 구별하여g (그림 2E). 여과 미개발 난자에서 완전히 개발 된 난 모세포를 분리하지 않을 것이며 그들은 종종 그림 5에서 볼 수있는 결함을 나타낼.......
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공개 사항
관심 없음 충돌은 저자에 의해 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) IOS 0,844,948 및 1,024,811 IOS에 의해 지원되었다
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1-메틸아데닌 | 아크로스 유기물(Fisher Scientific) | AC20131-1000 | |
| 190미크론 니텍스 나일론 필터 | 소형 부품(원래 Sefar) | CMN-0185-C/5PK-05 | |
| 100미크론 니텍스 나일론 필터 | 소형 부품(원래 Sefar) | CMN-0105-C/5PK-05 | |
| 폴리스티렌 페트리 접시, 60mm x 15mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| 모세관 튜브 | FHC, Inc | 30-30-0 | 미세 주입 바늘 |
| 모델 P-97 바늘 풀러 | 셔터 악기 | P-97 | |
| Dextran, Rhodamine Green | Life Technologies | D7163 | GFP 발현 리포터를 주입하는 경우, 텍사스 레드 덱스트란을 주입 추적기로 대체하는 것이 도움이 됩니다 |
| 인스턴트 오션 씨 솔 | 닥터 포스터 앤 스미스 | CD-116528 | 많은 애완동물 가게에서도 구매 가능 |
| : Microloader 팁 | Eppendorf | 5242 956.003 |
참고문헌
- Terasaki, M. Quantification of fluorescence in thick specimens, with an application to cyclin B-GFP expression in starfish oocytes. Biol. Cell Auspices Eur. Cell Biol. Organ. 98, 245-252 (2006).
- Terasaki, M., Runft, L.
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재인쇄 및 허가
