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방법 논문

마우스의 유방 지방 패드에 유방암 세포의 소성 주입은 종양의 성장을 연구한다.

80.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51967

⸱

2015년 2월 8일

 , 
1Department of Hemostasis and Thrombosis, Leiden University Medical Center

이 논문에서

요약

암 종양 주변 조직뿐만 아니라 로컬 프 및 항 염증 매개 의해 영향 복잡한 질환이다. 따라서, 오히려 피하 모델보다 이방성 주입 모델은 방식으로 더 잘 모방 인간의 병리 암의 진행을 연구하기 위해 유용 할 수 있습니다.

초록

유방암의 성장 모델의 과다 사용을 마우스에서 연구 될 수있다. 유방암 세포의 유전자 조작은 새로운 종양 억제제를 발견하도록 도움 또는 종양 진행에 관여하는 단백질의 기능에 대한 통찰력을 제공 할 수있다. 또한, 다른 유전자형 생쥐에 암세포를 주입하여 기질 구획의 중요성에 대한보다 나은 이해를 제공 할 수도있다. 대부분의 모델은 질병 진행의 특정 측면을 조사하는 것이 유용 할 수 있지만, 전체 암의 과정을 요점을 되풀이하지 않습니다. 대조적으로, 유방암 세포는 더 마우스 유방 지방 패드에 생착이 질환과 적절한 기질 구획의 존재 때문에 잘 모방 암성 인간 질병의 위치를​​ 되풀이. 이 글에서, 우리는 동소 마우스로 유방암 세포를 이식하고 분석 할 조직을 수집하는 방법을 설명하는 방법에 대해 설명합니다: 14px; 라인 신장. 28px; "> 종양 환경 및 전이 원격 장기에이 모델을 사용하여, 암의 여러 측면 (성장, 혈관 신생 및 전이)은 종양 세포의 성장을위한 적절한 환경을 제공하는 것만으로 조사 할 수있다.

서론

암은 수세기에 걸쳐위한 연구에 대상이되고있다 매우 복잡한 질환입니다. 유방암은 가장 흔한 암 타입이고; 그것은 여성에서 주로 발생하지만 산발적으로도 남성 (27)에 발생할 수 있습니다. 질병은 주로 다시 신체의 세포의 무한 성장 리드 제어 메커니즘 통치 세포 분열의 손실에 의해 야기된다. 이러한 고장은 여러 메커니즘에 의해 야기 될 수있다 : 먼저, 건강한 세포는 암세포가 자신의 성장 인자를 확인함으로써보다 증식 속도 하나를 획득하는 성장 인자 수용체의 발현을 증가 반면 증식하기 위해 주변 셀로부터의 성장 신호를 필요로; 둘째, 암 세포는 항 증식 신호 8에 덜 민감하다; 셋째,도 필요 본체 세포사의 셀 개수를 조정하는 단계; 그러나 암세포는 프로그램 된 세포 사멸에서 탈출 아폽토시스 14 불린다; 네 번째로, 세포 외 기질 (extracellular matrix)에 부착위해 생존하지만 종양 세포는 첨부 파일의 필요없이 성장하고 anoikis (19)에 대한 저항을 표시 할 수 있습니다; 다섯째, 텔로 머라 아제의 활성화는 텔로미어 단축을 우회하고, 복제 성 노화 (21)을 방지; 마지막으로, 변형 된 유전자 콘텐츠 (15, 16)의 유사 분열 결과 다음과 같은 DNA 품질 관리의 건너 뛰는. 이러한 탈 조절 된 증식에 중요한 역할을 종양 유전자 또는 종양 억제를 식별하기 위하여, 마우스에서 종양 성장 실험은 중요하다.

차 종양의 성장은 일반적으로 사망의 주요 원인이 아니다. 보조 사이트 차 사이트에서 암세포의 마이그레이션, 전이 되나, 대부분의 암 환자 22에서 사망의 주요 원인이다. 전이 차 사이트에서 면역 공격, 혈관 외 유출 및 성장을 방지 순환을 통해 여행, 종양 세포의 침윤을 수반 intravasation. 중간 엽 전이 (EMT)로 상피는 핵심 프로세스에전이 및을 전이 셀 (12)을위한 전제 조건입니다 더 높은 운동성 및 침입과 세포를 산출 유전자 발현 프로파일의 스위치를 포함한다. 암 처리는 암세포, 간질 세포 및 프로 및 항 염증 세포 간의 상호 작용을 포함하여 다양한 작업의 조합의 결과물이기 때문에, 암 관내 접근법은 종종 암 과정에 전체 통찰력을 제공하지 않는다. 유사하게, 종양의 혈관에 영향을 항암 치료는 종종 따라서 생체의 사용이 불가피하다 접근, 시험관 내에서 연구 될 수 없다.

유방암의 진행을 연구하기 위해, 다른 실험 방법이 개발되었다. 가장 널리 사용되는 모형 (5)에 마우스 유방암 세포의 피하 주사이다. 본 실험 구성에서, 연구자는 시험관 내에서 원하는 세포주 변경 폭넓게 도입 할 수있다 (즉,상향 조절, 단백질의 하향 조절) 및 피부에서 세포를 주입. 이 방법은 간단하고 사출 공정이 쥐에 수술을 수행 할 필요없이 간단하지만, 종양이 주입되는 위치는 유방암 개발 될 수 로컬 유방 종양 환경과이 환경의 부재를 나타내지 않는 것을 인간 병리학에서 관찰 다릅니다. 둘째, 유전자 조작 마우스는 유방암의 진행을 연구하는 생체 도구로 자주 사용된다. 이 모델에서, 종양 유전자 (즉 PyMT, 노이) 식 자발적인 유방 종양 (S)의 형성으로 이어지는 유방 조직 특이 적 프로모터에 의해 구동된다. 이 실험에서는 시간 3에서 종양의 크기를 확인하면서 약물이나 항체를 주입하여 질병의 치료 양상을 연구하는 데 유용합니다. 그러나, 결핍 또는 또한 인을 줄 수도 있습니다 관심의 유전자에 돌연변이 다른 마우스 변종 이러한 쥐를 사육유방 종양의 성장 (24)에서 상이한 단백질의 역할에 ights. 이러한 모델의 단점은 종양의 크기와 수에 변동되는 경향이 있다는 것이다. 또한, 유전자 발현 수준은 게놈 통합 사이트에 의존 한 다른 4 마우스 균주에서 변경할 수있다. 인간의 질환 세포의 하위 집단 만이 종양 유전자를 발현 또는 종양 억제 수준을 하향 조절하는 반면 26이 모델에서 트랜스 진의 발현은 상피 기원의 모든 세포에 의해 달성 될 수있다. 전이를 연구하기 위해, 유방암 세포는 또한 정맥 내 주사 될 수있다 (25) (모델 실험 전이 불린다). 그러나,이 방법은 부분적으로 만 전이 과정을 되풀이; 이는 종양 세포가 침입 및 intravasate위한 요건을 회피하고, 종양 세포가 용이 순환에 존재하는 지점으로부터 시작한다.

우리의 작업에서 우리는 동소 분사를 사용이온 모델은 유방암의 진행 (13)에 대한 관심의 유전자의 참여를 공부합니다. 우리는 인간 유방암 세포에서 단백질을 과발현 및 NOD / SCID 감마 (NSG) 마우스의 유방 지방 패드로 주입. 이 주입 된 세포주에서 매우 신속하고 다양한 유전 적 변화는, 그것이 병리학 중요한 부위에서의 전이에 일차 종양 성장과 유방암 진행하는 과정을 더 포함 허용하고, 또한 양호한 실험 모델을 제공한다 :이 방법은 여러 가지면에서 유리하다 질병의 초기 또는 후기 단계에서 치료 치료의 영향을 연구. 또한,이 모델을 사용하여 유 전적으로 변형 된 세포 또는 마우스를 이용하여 질병의 진행 암 세포 유래 단백질에 비해 기질의 역할을 조사 할 수있다. 피하 주사를 수행하기 쉽게되지만, 소성 모델은 더 이상 종양 형성 및 전이성 암 세포 집단을 야기. 따라서, 결과는 피하 주사의 방법에 의해 얻어진S는 위음성 또는 종양의 성장을 연구하는 소성 모델의 사용을 장려 6,17 위양성이 될 수 있습니다.

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프로토콜

동물 실험은 라이덴 대학 의료 센터 (LUMC)의 동물 복지위원회에 의해 승인되었다.

세포, 악기 및 마우스 1. 준비

  1. 작업을하기 전에 날, 중간 선에 네 번째 젖꼭지에서 NOD / SCID 감마 (NSG) 마우스를 면도하고 모든 마우스는 대략 비슷한 가중치가 있는지 확인하기 위해 마우스의 무게를.
  2. 두 개의 핀셋과 두 개의 직선 모기 집게 (그림 1A)를 가위를 압력솥.
  3. 수술 당일에, 인간 유방 선암 (MDA-MB-231) 인산 완충 생리 식염수 (PBS)로 한번 주입 될 세포, pH가 7.4를 씻어 내고 세포를 Trypsinize. 셀의 상부에 10 ㎖의 혈청 - 함유 DMEM 매체를 첨가함으로써 트립신을 켄 칭하고. 혈청없이 PBS 또는 미디어 중 하나 세포를 재현 탁하여 혈청을 제거하기 위해 실온에서 7 분 동안 1,200 rpm에서 세포를 원심 분리기. 완전히 혈청의 흔적을 제거하기 위해 다시 원심 분리기. PBS로 세포를 재현 탁하거나미디어.
  4. 혈구 세포와 세포의 개수와 크기를 계산. 하지 150 개 이상의 μL 500,000 세포 / 마우스를 사용합니다. PBS 또는 미디어 선택, 리겔에서 세포를 재현 탁.
    주 : 사용 된 세포 유형에 따라 세포의 양을 결정한다.
  5. 멸균 마이크로 원심 튜브에 세포를 넣고 얼음에 보관하십시오.
  6. 35 PBS pH를 7.4 ml의 70 % 에탄올로 다른 50ML 원뿔 원심 분리기 튜브 하나의 50 ML 원뿔 원심 분리기 튜브를 입력합니다. 각각의 튜브에 면봉을 적시.

2. 동소 이식 주입

  1. 멸균 분위기를 유지하기 위해 무균 후드에서 수술을 수행한다. / kg 체중 100mg을 각각 10 ㎎ / kg의 투여 량으로, 자일 라진 / 케타민 믹스를 피하 주사하여 마우스를 마취. 가열 패드에 마우스를 고정합니다. 발가락 핀치에 반응의 부족에 의해 마취의 성공을 확인합니다.
    참고 : 하나는 수술 절차에 익숙하지 않은 경우, 수술 시간이 더 걸릴 수 있습니다. 정렬마취는 이에 따라 복용량.
  2. 건조에서 눈을 방지하기 위해, 마우스의 눈 안과 연고를 적용합니다.
  3. 단계 1.6에서 제조 된 에탄올에 담근 면봉을 사용하여 면도 영역을 청소합니다. 계획 절개 사이트에서 떨어져 회전하는 원형 방식으로 베타 딘과 술을 세 번 사용하는 스크럽을 교류하는 수행해야합니다. 또한, 살균제 이온 운반체 사용합니다.
  4. 가위로 네 번째 젖꼭지와 중간 선 사이에 작은 절개를하고 PBS 산도 7.4 적신 면봉을 삽입하여 주머니를합니다.
  5. 유방 지방 패드를 노출 트위터를 사용합니다. 해당 흰색으로 지방 패드를 관찰합니다.
  6. 그것의 기초에서 다른 트위터와 지방 패드를 짜내; 이 작업을 수행하여, 완전히 쉽게 주사를 수행하기 위해 지방 패드 (그림 1B)를 노출합니다.
  7. 상하 피펫 팅하여 세포 혼합액 균질화. 부드럽게 인슐린 주사기로 세포 현탁액 50 μL를 대기음으로 주입수평으로 바늘을 누르고 있으면 유방 지방 패드. 지방 패드의 붓기를 확인하여 성공적으로 주사를 확인합니다.
  8. 부드럽게 지방 패드를 놓습니다.
  9. 바늘 드라이버를 사용하여 절개 봉합. 세 개의 시계 방향, 반 시계 방향 및 시계 방향으로 바늘 드라이버 주위의 봉합을 돌려 확인 던진다. 봉합 당 두 개의 노트를 사용할 필요가 있습니다.
    주 : 매듭 그렇지 않으면 마우스가 봉합을 열 수 있습니다 꽉 있는지 확인합니다.
  10. 수술 후 통증을 완화하기 위해 0.05-0.1 ㎎ / ㎏ 체중, 피하 그러한 temgesic 등의 진통제를 주입.
  11. 그들은 의식을 얻고 흉골 드러 누움을 유지 할 때까지 무인 동물을 방치하지 마십시오. 그들이 완전히 회복 될 때까지 다른 케이지에 모든 동물을 놓습니다.
  12. , 불임을 유지 멸균 된 케이지와 물을 사용하십시오. 깨끗한 분위기를 유지하기 위해 3 일마다 케이지를 변경합니다.

분석 3. 수확 기관

  1. 에서수확의 날, 팔주 세포의 주입 후, 각각의 마우스 3 ㎖ 보우 인의 솔루션으로 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브를 입력합니다. 또한, 마우스 당 5 ㎖ 포르말린 용액으로 채워진 두 15ml의 튜브를 사용한다.
  2. 10 ㎎의 투여 량으로, 자일 라진 / 케타민을 동물에 주입하여 마취 / 100 ㎎ / kg 체중 피하 kg. 동물 발가락 핀치 철수 반사 손실 될 때까지 기다립니다.
  3. 기본에 바늘 동물을 수정합니다. 가위로 긴, 수직 정중선 절개를합니다. 오른쪽 앞 다리 아래 뒤쪽 다리 위에 두 개의 수평 절개를합니다. 베이스에 피부를 달아하여 종양을 노출. 캘리퍼스를 이용하여 종양 체적을 측정한다.
  4. 가위를 사용하여 피부에서 종양을 해리. 스냅 RNA 분리 용 액체 질소에서 종양의 일부를 동결. 파라핀 삽입 다음과 면역 조직 화학 염색을 수행하기 위해 포르말린으로 가득 원뿔 원심 분리기 튜브에, 또 다른 부분을 놓습니다.
  5. 조심스럽게 폐를 꺼내. 배치보우 인의 솔루션으로 폐를 떠났다. 3 일 동안 용액에 폐를 유지합니다. 육안으로 명확하게 피상적 전이 병소를 관찰합니다. 선택적으로, 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 염색을 사용하여 미세 전이를 확인하기 위해 포르말린으로 우측 폐를 놓습니다.
    참고 : 폐 전이 유방암에서 자주 관찰되지만, 하나는 전이를 분석하기 위해 뼈, 간, 뇌, 비장를 수집 할 수 있습니다. 전이 영역의 세포 밀도 및 형태 학적으로 상이하며, 따라서, 폐 조직으로부터 쉽게 구별 될 수있다.
  6. 하루는 수확 후 15 ml의 튜브에서 포르말린 솔루션을 대기음 70 % 에탄올로 대체합니다. 파라핀의 조직을 포함하고 면역 조직 화학 연구를 수행합니다.
  7. 혈액 분석을 위해, 가위로 흉강을 엽니 다. 심장 구멍을 통해 450 μL 혈액을 철회. 3.2 % 시트르산 나트륨의 50 μl를 함유하는 마이크로 원심 분리 튜브에서 혈액 샘플을 놓는다. 피가 수집 된 후, 10 마일 2,000 XG에 그것을 회전N. 더 사용할 때까지 -20 ° C에서 플라즈마 샘플을 저장합니다.
    주 : 거기 (20)에 일반적으로 실제로 사용되는 여러 다른 혈액 수집 기술은 다음과 사용될 필요 기법과 실험 구성 과학자의 선택에 달려있다. 혈액 샘플이 필요하지 않은 경우, 프로토콜에 동물이나 기관 지침에 따라 동물을 따른 안락사.

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결과

"소성 유방암 모델"의 성공적인 적용은 유방 지방 패드로 세포의 적절한 주입에 기초한다. 이러한 세포 또는 누설 부정확 접종 같은 실험 오차는 종양 크기 또는 제어 버퍼 (도 2a)와 주입 유방 지방 패드에 유사하게 보이는 구조의 형성을 유도 종양조차없는 변형을 초래할 수있다. 종양의 성장 속도는 분사 된 세포주의 특성에 의존하고, 일반적으로, 마우스 (도 2B)의 피부를 통해 관찰 할 수있다. 시험 관내 실험과 달리, 종양 세포의 성장 속도는 생체 내에서의 시간 (도 2C)에서 일정하지 않을 수있다. 저산소증 및 영양소의 부족으로 인해, 괴사 영역을 형성 할 수 있으며 이러한 지역은 종양 (도 2D)의 성장 속도에 영향을 미칠 것이다. 또한, 관심있는 유전자는 특정 위상에 영향을 줄 수있는암의 진행 (초기 또는 후기), 따라서 실험 설정에 따라 종양의 성장이 빠른 시작하지만...

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토론

유방암 세포의 동 소성 분사 암 성장의 모든 측면을 연구하는 강력한 모델이다. 마우스의 유방 지방 패드에 이들 세포의 주입 신중 종양 성장의 편차를 방지하기 위해 수행되어야한다. 가장 중요한 것은, 각각의 마우스에 세포의 동일한 양을 주입하는 것이 중요하다. 이를 위해, 하나의 엄격 세포 생존 능력에 영향을주지 않고 세포를 Trypsinize한다. 비 가능한 세포는 생존 세포 수를 결정하는 데 유용 할 수 있습니다 죽은 생존 세포를 구별하는 데 도움이 될 수 있습니다 셀 카운팅 및 시약 (예 : 트리 판 블루) 동안 무시해야합니다. 세포 덩어리의 형성은 세포 덩어리가 형성 세포 카운팅하는 동안 문제가 생길 위아래로 피펫 팅하여 세포를 회피하고 세포 수의 계산 착오로 연결되어야한다. 고려해야 할 또 다른 중요한 양태는 세포 자체의 부피이다. 프로토콜 절에서 설명한 바와 같이 셀들 PBS 또는 미디어에서 그들을 중지하기 위해 펠렛된다. PBS 또는 매체를 추가하기 전에, 셀 볼륨은 서로 다른 볼륨의 매체로 채워진 ...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자는 네덜란드 과학연구기구(NWO, 보조금 17.106.329)에 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Bouin의 솔루션Sigma-AldrichHT10132폐의 전이를 조사하는 데 사용됩니다
포르말린 솔루션Sigma-AldrichHT501128조직을 고정하는 데 사용됩니다
Matrigel, 성장 인자 감소Corning356230세포는 주사를 위해 matrigel에 재현탁 할 수 있습니다
기 집게Fine Science Tools13008-12사용 stiching
각진 집게전자 현미경 과학72991-4c이들은 유방 지방 패드의 노출을 더 쉽게 만듭니다
가위B Braun MedicalsBC056R마우스를 자르는 데 사용
스트레이트 집게B Braun MedicalsBD025R노출시키기 위해 피부를 여는 데 사용됩니다
.실험에 사용되는 실험 동물
MDA-MB-231시그마-알드리치92020424주사에 사용되는 실험 세포
Oculentum simplexTeva Pharmachemie안구 건조를 방지하는 데 사용되는 안과 연고
BetadineFischer Scientific19-898-859수술 부위를 소독하는 데 사용되는 이오노포어
Xylazin/KetamineSigma-AldrichX1251, K2753주사 마취를 각각 10mg/kg 및 100mg/kg 체중으로 사용
TemgesicSchering-Plough진통제를 0.05-0.1 mg/kg 체중으로 사용
DMEMLife sciences11995트립신 중화를 위해 혈청(FBS:미디어 1:10 부피)이 있는 매체를 사용하십시오. 주사를 위해 혈청이 없는 매체를 사용하십시오
. 완충된 구연산나트륨AniaraA12-8480-10부피 비율을 구연산염 : 혈액으로 사용하십시오. 1:9
모 이것은 유방 지방 패드 NOD scid 감마 마우스 Charles River 005557를

참고문헌

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