يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إعداد الجرذ مصل مناسب للالثدييات الجامع الثقافة الأجنة

14.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51969

⸱

أغسطس 3, 2014

 ,  ,  , 
1Graduate School of Medicine, Jichi Medical University, 2Division of Biology, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 3Department of Developmental Neuroscience, United Center for Advanced Research and Translational Medicine (ART), Tohoku University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

تستخدم < p class = 'jove_content'> زراعة الجنين الكامل للثدييات (WEC) على نطاق واسع في علم المسخية وعلم الأحياء التنموي. عادة ما يتم توفير مصل الفئران بالطرد المركزي على الفور كوسيط لكل من الفئران والفئران WEC. في هذا الفيديو ، نوضح بروتوكولنا القياسي لإعداد مصل الفئران عالي الجودة المناسب ل WEC للثدييات.

الملخص

زراعة الأجنة الكاملة للثدييات (WEC) هي تقنية مستخدمة على نطاق واسع لفحص السمية الدوائية في تطوير أجنة الفئران والجرذان وللتحقيق في آليات عمليات النمو. يستخدم مصل الفئران بالطرد المركزي على الفور (IC) بشكل شائع في WEC وهو ضروري لنمو وتطور أجنة الفئران والفئران المستنبتة خارج الجسم الحي. بالنسبة لثقافة أجنة منتصف الحمل (أي E8.0-12.5 للفأر ، و E10.0-14.5 للفئران) ، فإن مصل الفئران بنسبة 100٪ هو أفضل وسيلة لدعم نمو الجنين خارج الجسم الحي. لتحضير مصل الفئران المناسب ل WEC ، يجب طرد الدم الذي تم جمعه على الفور لفصل خلايا الدم عن جزء البلازما. بعد الطرد المركزي ، تتشكل جلطة الفيبرين في الطبقة العليا. يجب عصر هذه الجلطة برفق باستخدام زوج من الملقط المعقم ثم الطرد المركزي لفصل خلايا الدم تماما عن المصل. في مقال الفيديو هذا ، نوضح بروتوكولنا القياسي لإعداد مصل الفئران IC الأمثل ، بما في ذلك جمع الدم من الشريان الأورطي البطني لذكور الفئران واستخراج المصل عن طريق الطرد المركزي.

المقدمة

وتستخدم مجموعة متنوعة من الحيوانات النموذج في البيولوجيا التطورية للتحقيق في الآليات التنموية على المستويين الجزيئي والخلوي. على سبيل المثال، استخدمت على نطاق واسع نوعا من البرمائيات والطيور كحيوانات النموذج الكلاسيكي التي هي مناسبة للتلاعب مباشرة من الأجنة لأن هذه الأجنة تطوير خارج الأم. وعلى النقيض من هذه الحيوانات، أجنة الثدييات ينمو في رحم الأم، والنمو في مراحل لاحقة تعتمد بشكل حاسم على وظيفة الرحم. وبالتالي، فمن الصعب عادة لمعالجة الأجنة مباشرة الثدييات مثل تلك التي من الماوس والفئران في مراحل مبكرة. في 1960s، التي أنشئت دينيس جديد الثدييات ثقافة الجنين كله (WEC) باستخدام تقنية الأجهزة WEC مع امدادات الاوكسجين المستمر ومراقبة الحرارة 1. في WEC، يمكن أن الماوس والفئران الأجنة تنمو خارج الجسم، (أي خارج الرحم). على الرغم من أن تقنية WEC كثيرا ما كان يستخدم في المسخ عن طريق إضافة مختلف كيميائيآل مركبات في مستنبت، كما تم استخدام هذه التقنية في مختلف الدراسات البيولوجيا التطورية لدراسة الآليات التنموية الفريدة في الثدييات 2-4. على سبيل المثال، يتم الجمع بين WEC مع تقنيات أخرى، مثل وضع العلامات الخلية، في البرية من نوع ومتحولة الأجنة باستخدام صبغة الفلورسنت 5، 6 زرع الخلايا، وإدخال الجين عبر lipofection 7 و electroporation 8-13.

في الآونة الأخيرة، في التلاعب الرحم وقد استخدمت لتحليل العمليات التنموية في الأجنة القوارض في مراحل لاحقة، وقد تم دمجها مع تقنيات التثقيب الكهربائي 14-16. ولكن هذه التقنيات ليست مناسبة للتلاعب من الأجنة postimplantation وmidgestation بسبب صعوبات تحقيق الحقن المحلية دقيقة من الحل الحمض النووي في الأجنة في المراحل المبكرة. على الرغم من أن زرع الخلايا الموجهة بالأمواج فوق الصوتية وحقن النواقل الفيروسية في الأجنة في وقت مبكر (أي، تم الإبلاغ عن E8.5-E-9.5 في الماوس) في الرحم سابقا 17،18، يطلب من مهارات ممتازة لتنفيذ هذه التجارب مع نسبة نجاح عالية. وبالتالي، مع إمكانية الوصول WEC عالية فيفو السابقين مزاياه فيما يتعلق التلاعب الماوس والفئران الأجنة.

وكثيرا ما يستخدم طرد فورا (IC) مصل الفئران المحضرة من الفئران الذكور لمتوسطة WEC. عند الأجنة هي مثقف في مرحلة postimplantation (أي، في وقت سابق من E8.0 في الماوس أو E10.0 في الفئران)، وغالبا ما يتم استخدام خليط من المتوسطة الاصطناعية وIC مصل الفئران كوسيلة للWEC 19. ولكن، لأجنة الثقافة في منتصف الحمل (أي.، E8.0-12.5 في أجنة الفئران أو E10.0-E14.5 في الأجنة الفئران)، ينبغي استخدام 100٪ مصل كوسيلة لأنه لا يوجد وسائل الإعلام البديلة المتاحة حاليا تسمح أجنة تنمو عادة في المختبر لأكثر من 2 أيام.

إعداد عالية الجودة مصل الفئرانخطوة حاسمة لتحقيق استنساخ التجارب في WEC. مقارنة تأخر الطرد المركزي، IC له فائدة في الحد من انحلال الدم عندما يتم جمع الدم عن طريق الضغط على تجلط الليفين لأن معظم خلايا الدم الحمراء وقد تم بالفعل فصل من جلطة الفيبرين. كما فشل مصل الفئران الانحلالي لدعم النمو الطبيعي للأجنة الجرذان والفئران، وإعداد المصل باستخدام الطرد المركزي المباشر هو الأفضل لإعداد باستخدام تأخر الطرد المركزي. بروتوكول لدينا يحتوي على اثنين من خطوات إضافية مقارنة مع غيرها من البروتوكولات 18-20 (مثال. وتخزين الدم التي تم جمعها على الجليد قبل الطرد المركزي الأول والحفاظ على عينات الدم التي تم جمعها لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية بعد الطرد المركزي الأول). الخطوة السابقة يمكن تأخير تشكيل تجلط الدم، والخطوة الأخيرة تعزز التصلب من جلطة الليفين لسهولة الضغط. لذلك، لدينا بروتوكول يمكن استخدامها من قبل المبتدئين. ومع ذلك، استنساخ جمع الدم والمصلاستخراج بدقة بمجرد اشارة الى الكتب البروتوكول هو في غاية الصعوبة 19-21. في هذه المقالة الفيديو، علينا أن نظهر بروتوكول لدينا معيار لإعداد الأمثل مصل الفئران IC، والذي يتضمن جمع الدم من الشريان الأورطي البطني من الفئران الذكور واستخراج المصل بواسطة الطرد المركزي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: تم إجراء التجارب على الحيوانات وفقا للمعاهد الوطنية للصحة دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. وافقت اللجنة لتجارب على الحيوانات في مدرسة جامعة توهوكو للطب الإجراءات التجريبية الموصوفة هنا.

1. التخدير وفتح البطن

  1. لجمع الدم، واستخدام الذكور الفئران معينة خالية من مسببات الأمراض سبراغ داولي. صيام الفئران لمدة 18 ساعة على الأقل مع توفير المياه. استخدام الفئران مربي متقاعد الذكور في 6-8 أشهر من العمر (550-650 ز) لجمع الدم.
  2. تدفق 2،5-4،0٪ isoflurane و، وهو مخدر الاستنشاق، في مربع متصلا جهاز التخدير لإدخال التخدير في 2،0-3،5 لتر / دقيقة لمدة 10 دقيقة. نقل الفئران في خانة لإدخال التخدير.
    1. تأكيد التخدير عن طريق التحقق من فقدان ردا على التحفيز على الكفوف بالملقط. تغطية الأنف من واي الفئرانال قناع متصلة جهاز التخدير لتخدير عميق الفئران خلال جمع الدم. يتم الحفاظ على تركيز وتدفق في 2،5-4،0٪ و2،0-3،5 لتر / دقيقة، على التوالي.
      ملاحظة: هالوثان لا ينبغي أن تستخدم للتخدير استنشاق لأن الأجنة مثقف في المصل التي تم تجميعها من الفئران تخدير مع هذا كاشف المعرض تأخير في التطور الجنيني مقارنة مع الأجنة مثقف في المصل تم الحصول عليها من الفئران تخدير مع isoflurane و22.
  3. لتجنب التلوث من الفراء، وتطهير الجلد عن طريق سكب الايثانول 70٪ على البطن من الفئران تخدير. التقاط الجلد تطهيرها وجدار البطن في المنطقة السفلية مع زوج من ملقط وقطع هذه الطبقات في وقت واحد تجاه المنطقة الصدر مع زوج من مقص كبير لفضح الأعضاء الداخلية. تعكس الأمعاء خارج تجويف البطن مع زوج من الملقط.
  4. قطع الجلد وجدار البطن في اتجاه أطرافه الخلفية معزوج من مقص كبير لمواصلة فضح منطقة البطن الخلفي. تعكس الدهون الزائدة خارج تجويف البطن مع زوج من الملقط.
  5. التقاط الدهون الحشوية في خط الوسط باستخدام اثنين من أزواج من ملقط وتقسيم الدهون بعناية في اتجاه مواز لفضح الشريان الأورطي البطني. كرر هذا الإجراء لتقسيم الدهون الحشوية في الاتجاه الطولي لتحديد بسهولة والتشعب من الشريان الأورطي البطني. بالإضافة إلى ذلك، الشريان الأورطي هو نابض ويمكن تمييزها من الوريد الأجوف المجاورة باستخدام هذه الخاصية.
  6. التقاط الدهون حول الشريان الأورطي البطني والتشعب بعناية مع اثنين من أزواج من ملقط وفصل الدهون في الشريان الأورطي البطني.

2. جمع الدم

  1. إدراج بعناية غيض من الإبرة G 21 متصلة حقنة 20 مل الجمجمة على الفور إلى التشعب من الشريان الأورطي، مع شطبة في اتجاه نزولي. عقد حقنة واحدةجهة، وسحب المحقنة ببطء لجمع 15 مل من الدم من الفئران الذكور.
  2. إزالة الإبرة من الحقنة، وتصب الدم في كل منهما 10 مل أنابيب الاختبار العقيمة الجليد الباردة (الشكل 1A). إبقاء الأنابيب على الجليد حتى الطرد المركزي لتأخير تشكيل تجلط الدم. تقليل الوقت الطرد المركزي بواسطة الطرد المركزي أنابيب عدة في وقت واحد.
  3. الموت ببطء الفئران تخدير عن طريق بضع الصدر وقطع القلب أو قطع الرأس.

3. الجرذ سيروم إعداد

  1. أجهزة الطرد المركزي الدم التي تم جمعها لمدة 5 دقائق عند 1،200 x ج ودرجة حرارة الغرفة (RT) لفصل الدم إلى الطبقات العليا والسفلي (الشكل 1C).
  2. إبقاء الأنابيب في 4 درجة مئوية لمدة ساعة 1.5-2 لإصلاح جلطة الفيبرين.
  3. التقاط جلطة الليفين في الطبقة العليا باستخدام زوج من ملقط المنحني، والضغط على تجلط الليفين لفصل المصل. ثم، اضغط على تجلط الليفين مع ملقط المنحني التي تواجه تأليفwnwards بالقرب من واجهة بين طبقتين (1D الشكل).
  4. كرر الخطوة 3.3 لمزيد من فصل جلطة الفيبرين.
  5. أجهزة الطرد المركزي أنابيب الاختبار لمدة 5 دقائق عند 1،200 x ج وRT (الشكل 1E).
  6. نقل بعناية المصل في أنبوب 15 مل العقيمة باستخدام ماصة معقمة في الصفحي مجلس الوزراء تدفق الهواء.
  7. أجهزة الطرد المركزي في مصل الفئران التي تم جمعها لمدة 5 دقائق عند 1،200 x ج وRT لإزالة أي خلايا الدم الحمراء المتبقية.
  8. تجميع المصل بعناية إلى الجديد 15 مل أنبوب تعقيم باستخدام ماصة معقمة لتجنب تلوث الخلايا الحمراء المتبقية في الجزء السفلي من الأنبوب (الشكل 1F).
  9. احتضان المصل في حمام الماء عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى تعطيل نظام المتممة.
  10. تبريد أنابيب المصل الفئران لRT في الصفحي مجلس الوزراء تدفق الهواء. وينبغي aliquoted المصل إلى 10 مل في أنابيب معقمة الفردية. تخزين الأنابيب في -20 درجة مئوية حتى استخدامها (الشكل 1H).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويبين الشكل 1 نتائج ممثل الإجراءات الموضحة لفصل خلايا الدم والمصل. نحن عادة الحصول على 15 مل من الدم من الفئران الذكور متقاعد (الشكل 1A). بواسطة الطرد المركزي، ويمكن فصل الدم التي تم جمعها إلى الطبقة العليا التي تحتوي على مصل وجلطة الليفين، والتي يشار مع سهم، والطبقة السفلى تحتوي على خلايا الدم (الشكل 1C). الأهم من ذلك، لا يمكن فصل عينات الدم الانحلالي في مصل الدم وطبقات (الشكل 1B). بعد خروجه من أنبوب في 4 درجات م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

النتائج استنساخه في التجارب WEC تعتمد على استخدام ذات جودة عالية IC مصل الفئران ودقيقة تقنية الجنين تشريح 3. لا تقصير فترة الصيام قبل جمع الدم بسبب الصيام هو ضروري لتوحيد تركيزات الجلوكوز في الدم. لا ينبغي أن تستخدم إناث الفئران من أجل إعداد المصل لأن مستويات هرمون تغيير في إناث الحيوانات وفقا لدورة ودقي، وهذه التغيرات في الهرمونات استراديول غير مناسبة للثقافات الجنين. بالإضافة إلى ذلك، لا ينبغي أن تستخدم الفئران الذكور الدهنية للغاية لإعداد مصل لتجنب كمية كبيرة من التل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نشكر السيد هاجيمي إيتشيجو على تسجيل الفيديو والنصائح المفيدة فيما يتعلق بتحرير الفيديو. كما نشكر أعضاء مختبر أوسومي على رعاية. هذا العمل مدعوم من قبل منحة المعونة للبحث العلمي في المجال المبتكر والتنوع العصبي والتنظيم الكورتيولوجي الحديث ، من MEXT اليابانية (إلى N. O.). تم دعم T.K. من قبل زمالة بحثية من JSPS للعلماء الشباب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
IsofluraneAbbottB506لتخدير الفئران.
مقص كبيرNapoxB-7Hمقص مقص لقطع جلد وعضلات الفئران. 
ملقط منحنيNapoxA-3-2ملقط متجسح لالتقاط جلد الفئران والضغط على جلطة الفيبرين.
مختبرات Sprague-Dawley (SD) الفئرانتشارلز ريفرزمن الجرذان الذكور المتقاعدين من المستعمرة في المختبر أو اشترت الفئران الذكور المتقاعدين.
حقنة (20 مل) إبرةTERUMOSS-29ESZ
(21 جم × 5/8 بوصة) أنبوباختبار معقم TERUMONN-2116R
(سبيتز) (10 مل)ASIAKIZAI1101C000B-10لجمع
ماصة معقمة يمكن التخلصEiken ChemicalCD2000 رقم 4
أنبوب Sterilie القابل للتصرف (15 مل) & nbsp ؛فالكون2196
منها

المراجع

  1. New, D. A. T. Introduction. Mammalian Postimplantation Embryos. A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford, UK. 1-14 (1990).
  2. Eto, K., Takakubo, F. Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis. J Craniofac Genet Dev Biol. 5, 351-355 (1985).
  3. Takahashi, M., Osumi, N. The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system. J Vis Exp. (42), e2170(2010).
  4. New, D. A. Whole embryo culture, teratogenesis, and the estimation of teratologic risk. Teratology. 42, 635-642 (1990).
  5. Matsuo, T., et al. A mutation in the Pax-6 gene in rat small eye is associated with impaired migration of midbrain crest cells. Nat Genet. 3, 299-304 (1993).
  6. Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5. Development. 133, 1335-1345 (2006).
  7. Yamamoto, M., et al. Nodal antagonists regulate formation of the anteroposterior axis of the mouse embryo. Nature. 428, 387-392 (2004).
  8. Inoue, T., et al. Role of cadherins in maintaining the compartment boundary between the cortex and striatum during development. Development. 128, 561-569 (2001).
  9. Takahashi, M., Osumi, N. Pax6 regulates specification of ventral neurone subtypes in the hindbrain by establishing progenitor domains. Development. 129, 1327-1338 (2002).
  10. Calegari, F., Haubensak, W., Yang, D., Huttner, W. B., Buchholz, F. Tissue-specific RNA interference in postimplantation mouse embryos with endoribonuclease-prepared short interfering RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14236-14240 (2002).
  11. Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev Growth Differ. 50, 485-497 (2008).
  12. Pryor, S. E., Massa, V., Savery, D., Greene, N. D., Copp, A. J. Convergent extension analysis in mouse whole embryo culture. Methods Mol Biol. 839, 133-146 (2012).
  13. Kikkawa, T., et al. Dmrta1 regulates proneural gene expression downstream of Pax6 in the mammalian telencephalon. Genes Cells. 18, 636-649 (2013).
  14. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  15. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
  16. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
  17. Turnbull, D. H. Ultrasound backscatter microscopy of mouse embryos. Methods Mol Biol. 135, 235-243 (2000).
  18. Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J Vis Exp. (45), e2047(2010).
  19. Quinlan, G. A., Khoo, P. L., Wong, N., Trainor, P. A., Tam, P. P. Cell grafting and labeling in postimplantation mouse embryos. Methods Mol Biol. 461, 47-70 (2008).
  20. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R. Roller culture of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R. , 3rd ed, CSH Press. New York, New York. 237-241 (2003).
  21. Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 391-393 (2011).
  22. Brown-Woodman, P. D., Ritchie, H. E., Korabelnikoff, A., Emmanuel, C. Replacement of ether with alternate volatile anesthetics for collection of rat serum used in embryo culture. Toxicol In Vitro. 18, 719-724 (2004).
  23. Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J Vis Exp. (56), e3132(2011).
  24. Machado, C. B., et al. Reconstruction of phrenic neuron identity in embryonic stem cell-derived motor neurons. Development. 141, 784-794 (2014).
  25. Glanville-Jones, H. C., Woo, N., Arkell, R. M. Successful whole embryo culture with commercially available reagents. Int J Dev Biol. 57, 61-67 (2013).
  26. Ornoy, A., Yacobi, S., Yaffee, P. A simple method of culture of 11.5-day-old rat embryos in DMEM/F12 and 20% fetal bovine serum. J Anat. 203, 419-423 (2003).
  27. Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
  28. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System. J Vis Exp. (85), e50308(2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تحضير مصل الجرذانالطرد المركزي الفوريجمع الدمإزالة خثرة الفيبرينمنع انحلال الدمتعقيم المصلتثبيط المتممةوسط زراعة الأجنةمعالجة دم الجرذان
إعداد الجرذ مصل مناسب للالثدييات الجامع الثقافة الأجنة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.