Ein Modul für einzelne Ebene Illumination Microscopy (SPIM) beschrieben, die leicht zu einer umgekehrten Weitfeld-Mikroskop angepasst ist und für 3-dimensionale Zellkulturen optimiert. Die Probe wird in einer rechteckigen Kapillare angeordnet ist, und über ein Mikrofluidiksystem Fluoreszenzfarbstoffe können pharmazeutische Mittel oder Arzneimittel in kleinen Mengen angewendet werden.
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Methodenartikel
Einzigen Ebene Beleuchtungsmodul und Micro-Kapillar-Ansatz für ein Weitfeld-Mikroskop
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Ein Modul für Lichtbogen oder einzelne Ebene Illumination Microscopy (SPIM) beschrieben, die leicht zu einem umgekehrten Weitfeld-Mikroskop angepasst ist und für 3-dimensionale Zellkulturen optimiert, zB mehrzelligen Tumorsphäroide (MCTS). SPIM Anregungsmodul Formen und lenkt das Licht, so dass die Probe durch einen Lichtschnitt senkrecht zur Detektion Gang des Mikroskops beleuchtet. Das System wird durch Verwendung einer rechteckigen Kapillare zur Aufnahme (und in einer erweiterten Version auch durch eine Mikrokapillare Ansatz zum Drehen) der Proben, durch synchrone Verstellung der Beleuchtungslichtbogen und der Objektivlinse für die Fluoreszenzdetektion verwendet wird, sowie dadurch gekennzeichnet, durch Anpassung eines mikrofluidischen Systems zur Anwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, pharmazeutische Mittel oder Arzneimittel in kleinen Mengen. Ein Protokoll für die Arbeit mit diesem System gegeben wird, und einige technische Details berichtet. Repräsentative Ergebnisse umfassen (1) Messungen der bisnehmen eines Zytostatikums (Doxorubicin) und dessen teilweise Umwandlung in ein Abbauprodukt, (2) Redox-Messungen unter Verwendung einer genetisch codierten Glutathion Sensor bei Zugabe eines Oxidationsmittels, und (3) die Einleitung und Kennzeichnung Zellnekrose auf Hemmung der mitochondrialen Atmungskette. Unterschiede und Vorteile der vorliegenden SPIM Modul im Vergleich mit bestehenden Systemen diskutiert.
Einleitung
Neben den gut etablierten Methoden (oder konfokalen Multi-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie 1-4, Structured Illumination Microscopy 5,6) Lichtbogen oder einzelne Ebene Illumination Microscopy (SPIM) hat sich als eine wertvolle Methode der 3D-Bildgebung 7,8 sein, 9. Von besonderem Interesse ist die Anwendung eines 3-dimensionalen Zellkulturen, beispielsweise multizellulären Tumor-Sphäroide (MCT), die zunehmend für die Wirkstoffforschung 10,11 verwendet werden. Darüber hinaus ist eine bevorzugte Methode SPIM, wenn auch bei langfristiger Exposition oder sich wiederholende Messungen schlechten Licht Dosen sind erford....
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Protokoll
1. Zell Sphäroid wächst und Inkubation
- Versuch 1: Zell Sphäroiden mit einem Chemotherapeutikum inkubiert
- Bereiten Agarose 1,5% im Kulturmedium durch Zugabe von 0,45 g Agarose auf 30 ml Kulturmedium (ausreichend für 6 Platten).
- Das Gemisch aus Schritt 1.1.1 auf mindestens 80 ° C unter Rühren von Zeit zu Zeit.
- Füllen Sie 50 ul der erhitzten Mischung aus Schritt 1.1.2 in jedes Well einer 96-Well-Platte und lassen Sie es in 1-2 Stunden fest werden. Lagern Sie die Platten geschlossen und abgedeckt im Kühlschrank bei 5 ° C bis zur Verwendung.
- Samen etwa 150 MCF-7-Brustkrebszellen in jeder Vertiefung der hergestellten Platte....
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Ergebnisse
Versuch 1: Zell Sphäroiden mit einem Chemotherapeutikum inkubiert
Ein Z-Stapel-Scan eines zuvor inkubiert MCF-7-Zell-Sphäroiden (8 uM Doxorubicin, 6 h) wird in Abbildung 3 dargestellt. Es gibt ausführliche Informationen über die zelluläre Aufnahme und Verteilung von Doxorubicin 17 und seinem Abbauprodukt 18,19. In der äußeren Zellschicht der Sphäroid roten Fluoreszenz Doxorubicin wird hauptsächlich im Zellkern lokalisiert, während in de.......
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Diskussion
Die vorliegende Manuskript beschreibt ein Lichtbogen oder einzelne Ebene Illumination Microscopy (SPIM) Gerät, das für 3-dimensionale Zellsysteme optimiert ist, zB, mehrzelligen Tumorsphäroide (MCTS). Drei beispielhafte Anwendungen umfassen (1) die Aufnahme eines Zytostatikums und dessen teilweise Umwandlung in ein Abbauprodukt (deren Beitrag zur chemotherapeutischen Wirksamkeit bleibt ausgewertet werden), (2) Messung des Redox-Zustand durch Verwendung einer genetisch codierten Glutathion Sensor auf Zugabe eine.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Dieses Projekt wurde vom Land Baden-Württemberg sowie von der Europäischen Union, Europäischer Fonds finanziert für sterben Regionale entwicklung. Die Autoren danken Rainer Wittig (ILM Ulm) für die Bereitstellung der U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 Zelllinie und Claudia Hintze für geschickte technische Hilfe.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Mikrotiterplatte | Orange Scientific | 4430100 | Für das Wachstum von Sphäroidzellen |
| Agarose | Carl Roth GmbH | 3810.1 | Für die Zellsphäroid-Züchtung |
| MCF-7 Zelllinie | CLS Cell Lines Service GmbH | 300273 | |
| Zelllinie U251-MG-L106 Zelllinie | |||
| Zelllinie DMEM | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG0435 | Kulturmedium |
| DMEM/Ham's F-12 | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG4815 | Kulturmedium |
| FCS | Biochrom AG (Merck Millipore) | S0615 | Zellkulturergänzungsmittel |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG (Merck Millipore) | A 2213 | Antibiotika |
| Hygromycin B | PAA Laboratorien | P02-015 | Antibiotikum |
| EBSS | Sigma-Aldrich Inc. | E3024 | Nahrungsergänzungsmittel für Zellkulturen |
| Doxorubicin | Sigma-Aldrich Inc. | D1515 | Fluoreszierender Farbstoff (ACHTUNG: akute Toxizität) |
| Grüner Zytotoxizitätsfarbstoff | Promega GmbH | G8742 | CellTox - fluoreszierender Zytotoxizitätsfarbstoff |
| Rotenon | Sigma-Aldrich Inc. | R8875 | Zellulärer Inhibitor (VORSICHT: akute Toxizität) |
| Wasserstoffperoxid (H2O2) | Sigma-Aldrich Inc. | 95302 | Reagenz zur Oxidation (ACHTUNG: akute Toxizität) |
| Kapillares | VitroCom | 8260-050 | Probenvorbereitung |
| Mikroskop | Carl Zeiss Jena | Axiovert 200M | |
| AxioCam MRc CCD-Kamera | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | 426508-9901-000 | CCD-Kamera |
| AxioVision Datenerfassungssoftware | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | Version 4.8.2. | |
| Laserdiode | Pico Quant GmbH | LDH-P-C-470 | Verwendet mit Treiber PDL800-B |
| Schlauchpumpe | Ismatec Labortechnik | MS-1 Reglo | Neu kalibriert, um die minimale Pumpendrehzahl um 1/10 |
| Silikonschläuche | IDEX Health & Germany Science GmbH | TYGON R3607 |
Referenzen
- Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. , Plenum Press. New York. (1990).
- Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Rep. Prog. Phys. 59, 427-471 (1996).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W.
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Nachdrucke und Genehmigungen
