この記事では、合成とナノ粒子（NPS）の蛍光標識するための方法を説明します。 NPは、真核細胞のエンドリソソーム系を標識するために、パルスチェイス実験に適用した。細胞内病原体サルモネラ·エンテリカの活動によって、エンド-リソソームシステムの操作は、ライブセルイメージングが続き、定量化した。
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この記事について
サマリー
要約
望ましい化学的、光学的および機械的特性を有する蛍光ナノ粒子（NPが）、細胞内小器官を標識するための有望なツールである。ここでは、真核細胞のエンド-リソソームシステムにラベルを付け、細胞内病原体サルモネラ·エンテリカによりホスト細胞経路の操作を監視するために金-BSA-ローダミンNPSを使用する方法を紹介します。 NPは容易に後期エンドソーム/リソソームにHeLa細胞によって内在して局在していた。 サルモネラ感染症はSalmonella-誘起膜構造における小胞およびNPの蓄積の再配置を誘導した。我々は、共焦点顕微鏡画像の定量分析のためのIMARISソフトウェアパッケージを展開。非感染細胞内のオブジェクトの数とそれらのサイズ分布は、WT サルモネラによってエンドリソソーム系の非常にリモデリングを示す、 サルモネラ感染細胞におけるものとは異なっていた。
概要
金属などのNP、量子ドット、ポリマーのNP、シリカNPは、カーボンドットを含む、蛍光ナノ粒子（NPは）、過去数十年の間、1,2-かなりの注目を集めている。従来の有機染料に比べて、蛍光性NPは、このような強力な信号強度、光退色に対する抵抗性及び生体適合性の高い3,4のような望ましい化学的、光学的および機械的特性を示す。これらの利点は、それらの細胞内のセンシングと生細胞イメージングのための選択の方法にする。さらに、電子密度の高いNPの様々な生細胞の組み合わせは、光学顕微鏡（LM）とEM 5と超微細構造レベルでのより高い分解能でトラッキングすることができ、相関顕微鏡分析のためのそれらの使用を容易にする、電子顕微鏡（EM）から見える。例えば、金NPは、効率的に感受性の診断のための生細胞におけるバイオセンサーとして、ならびに免疫標識6の分野で使用される長い時間であった。最近のStudiesは、異なるサイズおよび形状を有する金NPが容易に大きな電位が細胞内小胞輸送の追跡およびエンドリソソーム系標識7,8を申請しているため、細胞株の大様々な取り込みおよび日常エンドソーム経路を介して輸送され得ることを示す。
そのようなサルモネラ·エンテリカ 、 赤痢菌およびリステリアなどの微生物病原体は、非食宿主細胞9....
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プロトコル
10nmの金ナノ粒子（ゴールドNPS）15の1の合成
- 溶液Aを準備します160ミリリットルミリQ、または再蒸留水に2ミリリットル1％水溶液塩化金を追加します。
- 溶液Bを準備します32ミリリットルミリQ、または再蒸留水に8ミリリットル、1％のトリクエン酸ナトリウム×2、H 2 Oおよび160μlの1％タンニン酸を追加します。
- 60℃に溶液A及びBをウォームアップし、攪拌しながら、それらを混合する。すぐに濃い青色を観察します。約15分後に赤色を観察します。その後、95℃まで加熱し5分間保持し、RTに溶液を冷却する。
- カーボンコーティングされたグリッド上にNP懸濁液のドロップを追加し、空気中で乾燥させる。透過型電子顕微鏡によってNPの大きさや形態を確認してください。
ローダミンN-ヒドロキシエステル（NHS）とBSAとラベリングゴールドNPの2コーティング16
- 、1.5mlのエッペンドルフチューブに900μlの30分間15000×gで遠心機を金NPSを追加します。オペアンプtionally月一度に複数のチューブを準備します。
- 、900μlのペレットに滅菌ミリQ水を再懸濁し、100μlの2mg / mlのBSA / PBSを追加し、上清を捨て、30分間、800rpmでボルテックスに混ぜる....
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結果
金NPは、クエン酸、タンニン酸による塩化金酸の還元を介して、十分に確立された方法により作製した。 図2Aに示すように、合成された金NPは、約10nmのサイズを有する形状に準球形であった。 BSA-コーティングおよびローダミン標識は、それらの形態や大きさ（ 図2B）に影響しませんでした。
これは、金NPは容易に種々の哺乳動物細胞により取り込まれ、エンドサイトーシスシステム7で終わったことが報告されている。以前の研究によれば、明るい赤色の蛍光シグナルは、細胞によるNPの効果的な内部移行を示す、金BSA-NPはローダミン（ 図3、WT 5時間のπ）で1時間のインキュベーション後にHeLa細胞において観察された。赤の信号のほとんどは、NPのが後期エンドソームまたはリソソーム中に閉じ込められたことを示し、緑のシグナルと共局在が認められた。しかし、後期エンドソーム/リソソームにおけるNPの一様分布とは異なり、非感染細胞（ 図3、モック）で.......
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ディスカッション
哺乳動物細胞のエンドリソソーム系は、栄養吸収、ホルモン媒介性シグナル伝達、免疫監視、および抗原提示17を含む重要な生理的過程を制御する。これまで、種々のマーカーは、エンドサイトーシス経路および追跡調査を標識するために使用されてきた。例えば、リソトラッカープローブは、選択的に低い内部pHの細胞区画に蓄積し、効果的にナノモル濃度18に住んで細胞を標識することができリソソーム標識に分子プローブ（ライフテクノロジーズ、米国）が開発した蛍光acidotropicプローブ、である。しかしながら、細胞とリソトラッカープローブの長時間のインキュベーションは、リソソームpHの上昇を誘導し、リソソーム19の潜在的な生理学的変化をもたらし得る。フルオロフォアで標識されたデキストランのようないくつかの大きな生体分子は、また、しばしば、エンドソーム/リソソームの標識に使用される。しかし、低光安定性、短い循環寿命、およびp定着時OOR保持が長期の生細胞イメージングでアプリケーションを妨げると相関顕微鏡は16,19を研究。ここで、金BSA-ローダミンNPは、宿主細胞のエンドリソソ.......
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
謝辞
この研究は、Sonderforschungsbereich 944 'Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments' と HE1964/18 within priority program 1580 の助成金Zにより、Deutsche Forschungsgemeinschaftによって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 塩化金 | Sigma-Aldrich | 520918 | |
| タンニン酸 | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| クエン酸三ナトリウム | Σ C8532 | ||
| ウシ血清アルブミン | Σ | A2153 | |
| NHS-ローダミン | ピアス | 46406 | |
| DMSO | Σ D8418 | ||
| HEPES | シグマ | H3375 | |
| ゲンタマイシン | Applichem | A1492 | |
| Kanamcyin | Roth | T832 | |
| カルベニシリン | ロス | 6344 | |
| 8 ウェル チャンバー スライド | イビディ | 80826 | 組織培養処理済み、滅菌 |
| イマリス ソフトウェア | ビットプレーン | バージョン 7.6 | さまざまな構成が利用可能 |
参考文献
- Coto-Garcia, A. M. Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics. Anal. Bioanal. Chem. 399, 29-42 (2011).
- Xie, J., Lee, S., Chen, X. Nanoparticle-based theranostic agents. Adv. Drug Deliv. Rev. 62
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再版と許可
