Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальные протоколы, описанные здесь проводится на Среднем Западе университета были утверждены на Среднем Западе университета IACUC.
1. Требования номер
- Закрепите процедуру комнату, которая работает горячая и холодная вода, и способ удаления воды из бака, обычно слив в полу.
- Используйте таблицу исследование, на котором можно разместить бак для дайвинга. Поскольку номера с люков, как правило, контуры для дренажа, сократить резиновые пробки и поставить их под ножек стола, чтобы убедиться, что столешница, и, следовательно, поверхность воды в баке, является уровень.
2. Дайвинг Танк
- Дайвинг Танк Строительство
- Построить прямоугольную бак (100 х 60 х 15 см), используя 3/4 в толстых оргстекла для нижней и 1/2 в оргстекла для боковых стенок (рисунок 1). Постоянно прикрепить снаружи оргстекла куски танка, а с помощью цианакрилатного цемент или solvenTS, такие как трихлорметане.
- Разделите танк в 5 каналов каждый около 100 см в длину, с помощью съемных 1/2 дюйма толщиной оргстекла нарезать 85 х 15 см кусочки. Постоянно разместить канавок в нижней и края резервуара, в который эти канальные делители можно вставлять в положении.
- Приостановить горизонтальные оргстекла куски из канала делителей создать "крышу" для подводного погружения "туннеля.
- В одном углу места танка съемный помост, "отделка площадь", для крыс возить из воды и отдохнуть между купания и подводного плавания испытаний. Крысы, как правило, ухаживают за собой и удалить воду из их меха в то время как в зоне финиша. Поместите высокие стороны по краям зоны финиша, чтобы обеспечить крысы остаются на платформе между учебными испытаний.
- На противоположном углу резервуара от финишной зоны разместить камеру, которая позволяет только подводный доступ к лабиринту. Это съемный "начатьРи "используется только для дайвинга испытаний.
ПРИМЕЧАНИЕ: В начале судебного разбирательства дайвинг крыса опускается в воду, сидя на платформе в начальной камере; следовательно эта платформа называется "лифт".
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте модульную конструкцию, где начало область, отделка область, и все каналы делители съемный из бака. Это делается по двум причинам: 1) чтобы облегчить наполнения и опорожнения в бак с водой после удаления всех каналов делителей, и 2) если крыса получает дезориентированы, особенно под водой, кусочки можно быстро разобраны, чтобы спасти крысу от вода.
- Заполнение и опорожнения резервуара с водой
- Наполнение резервуара водой
- В начале каждой тренировки, заполнить бак с пресной 32 ° C водопроводной водой на глубину около 12 см. Размешайте воду в баке, чтобы минимизировать теплые или прохладные карманы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, она занимает около 2 ч тренироваться по 12 крыс. В течение этого времениТемпература воды уменьшается примерно 4 ° С. К концу тренировки вода остывает до приблизительно 28 ° С. С 30 ° С вода термонейтральное крысам, используя эту теплую воду, а не водой комнатной температуры, позволит свести к минимуму потери тепла во время повторного обучения.
- В начале каждой тренировки, заполнить бак с пресной 32 ° C водопроводной водой на глубину около 12 см. Размешайте воду в баке, чтобы минимизировать теплые или прохладные карманы.
- Опорожнения резервуара с водой
- В конце каждой тренировки, слить воду из бака с помощью большой шланг, такие как 4-м длинной части 1 дюйма внутреннего диаметра трубы. Полностью погрузите трубку в баке, обеспечивая воздушных карманов не в трубке. Быстро разместить один конец трубки в канализацию пола. Полученный эффект будет сифона слива воды из бака.
- Удерживая конец бака от трубки под поверхностью воды, чтобы поддерживать сифонный, чаевые танк на краю для облегчения полного слива воды.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, и вместо того, перекачивая, установить кран у основания резервуара, и подключенияшланг от бака нажмите на канализацию пола.
- Наполнение резервуара водой
3. Крыса Аллерген Соображения
- Одноразовые перчатки, когда обработка и подготовка крыс. Перчатки будет ограничить контакт с водой в резервуаре, который всегда будет содержать моче крыс.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крысы будет мокнуть во время обучения, и комната будет заполнена "мокрого крысы" запахом. Следовательно профилактический режим антигистаминов могут предотвратить или ограничить воздействие аллергии у крыс. Тренеры могут также должны носить одноразовые респираторы или N95 маски, если они будут чувствительны к крысы аллергенов.
4. Swim Обучение
- Ежедневные тренировки плавать
ПРИМЕЧАНИЕ: Личный опыт показывает, что молодые крысы узнать лабиринт быстрее и лучше, и, таким образом, начиная обучение с 35 г вновь отлученных крыс предпочтительнее с помощью взрослых крыс.- Заполните бак водой. Смотрите 2.2.1.
- Вставить отделкаплощадь и канальные делители для создания 5 плавательных каналов.
- Во время первой тренировки осторожно опустите крыс вручную в воде около 3-5 см от финишной зоны.
ПРИМЕЧАНИЕ: При их введение в водных крыс появится шатается, как они впервые столкнулись ощущение плавающей. Крысы будут грести о некоординированно, пытаясь найти способ, чтобы выйти из воды, в конечном итоге близлежащий район финишную. Из-за их врожденной способностью плавать, в последующих исследованиях крысы будут плавать в гораздо более скоординированно к финишной зоне.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержка крыс из-под так их ноги на следователей руках. Аккуратно опустите крыс в воду, и пусть они уплывают из рук, а не бросая их в воду. - Между испытаний пусть крысы остаются в зоне финиша не менее 1 мин. Это сделано, чтобы крысы жениху и исследовать, так что они рассматривают зону финиша, как «безопасное» местоидти между испытаниями. Это в отличие от захвата крысу, которая только что завершил судебный процесс и сразу позиционирует его обратно в воду, чтобы начать следующий процесс.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте внешний награду (то есть, еда) в ходе обучения, с тем, чтобы предотвратить активацию вознаграждения схем в мозге. - После отделки площадью периода ожидания, мягко держать крыс в течение 1 мин до начала следующего судебного разбирательства. Аккуратно высушите крыс с полотенцем в течение этого предварительного удержания после повторного входа в воду вызовет крыс, чтобы получить очень влажный, и их сушки будет предотвратить переохлаждение.
- Повторите 4.1.3. через 4.1.5. для завершения 3 до 5 испытаний для каждой крысе обучаться во время ежедневной сессии плавать подготовки.
- Удалите все канальные делители и закончить область из бака.
- Слива воды из бака. Смотрите 2.2.2.
- Еженедельная плавать график обучения
- Проведение ежедневно тренинги (см 4.1.) 5 дней в неделю, в идеале, в то же времякаждый день.
- Начните первый судебный процесс с расстояния успешно провела переговоры в предыдущий день. Начало второго и третьего испытания с увеличенным расстоянием.
- С каждой последующей ежедневной тренировки увеличить расстояние между где крыс помещают в воду и финишной зоны. В течение первых нескольких тренировок увеличить это расстояние на 5-10 см. После крысы появляются более комфортно с плаванием, увеличить расстояния 30-50 см.
- Используйте более значительное увеличение в расстояниях плавательных а крысы учатся плавать прямую часть плавания канала. В отличие от этого, учиться плавать в крутые повороты между каналами может занять 2-3 учебных занятий.
ПРИМЕЧАНИЕ: Часто во время ожидания в зоне финиша, крысы вновь войти в воду, чтобы плавать, и / или погрузите их головы под водой в то время как до сих пор сидит на финиш площади платформы. - Повторите эту ежедневную протокол подготовки более 3 недель, чтобы обеспечить успешное плавание из целых 5 каналов.Это скучный протокол обучение обеспечивает успешное завершение лабиринт, тем более, что лабиринт включает чередующихся левых и правых крутых поворотов.
5. Погружение Обучение
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как крысы научились успешно вести переговоры плавание через лабиринт они готовы начать обучение погружения.
- Начальное обучение погружения (первый день)
- Вставьте стартовый камеру. Заполните бак с водой (см 2.2.1.). Уровень Убедитесь воды на 1 см ниже открытия в стартовой зоне.
- Вставьте финишную зону и канальные делители для создания 5 плавательных каналов.
- Во время первого сеанса водолазного обучить крысы быть снижена на лифте в воду в течение начальной камере. Доступ к лабиринту от нижней части камеры пуска. В течение этого первого сеанса уровень воды достаточно низка, так что крысы могут легко плавать от начальной камеры в лабиринте. Разрешить крыса продолжать плавание через лабиринт котделка область.
- Между испытаний пусть крысы остаются в зоне финиша не менее 1 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте внешний награду (то есть, еда) в ходе обучения, с тем, чтобы предотвратить активацию вознаграждения схем в мозге. - После отделки площадью периода ожидания, мягко держать крыс в течение 1 мин до начала следующего судебного разбирательства. Аккуратно высушите крыс с полотенцем в течение этого предварительного удержания.
- Повторите 5.1.3. через 5.1.5. для завершения 3 испытания для каждой крысе обучаться в течение этого начального обучения погружение сессии.
- Удалите все канальные делители, начать камеру и закончить область из бака.
- Слива воды из бака. Смотрите 2.2.2.
- Начальное обучение погружения (второй день)
- Вставьте стартовый камеру. Заполните бак с водой (см 2.2.1.). Убедитесь, уровень воды чуть выше открытия в стартовой зоне.
- Вставьте финишную зону и канальные делители для создания 5 плавательных каналов.
- Во время второго погружениятренировка уровень воды был поднят так, что для выхода из начала камеру крыса имеет окунуть голову под край стартовой камеры, чтобы войти в лабиринт. Считайте, что это, как первое погружение крысы. Дайте крысе затем продолжить плавание через лабиринт к финишной зоне.
- Пусть крысы остаются в зоне финиша, по крайней мере 1 мин между испытаниями.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте внешний награду (то есть, еда) в ходе обучения, с тем, чтобы предотвратить активацию вознаграждения схем в мозге. - После отделки площадью периода ожидания, мягко держать крыс в течение 1 мин до начала следующего судебного разбирательства. Аккуратно высушите крыс с полотенцем в течение этого предварительного удержания.
- Повторите 5.2.3. через 5.2.5. для завершения 3 испытания для каждой крысе обучаться в течение этого погружения тренировке.
- Удалите все канальные делители, начать камеру и закончить область из бака.
- Слива воды из бака. Смотрите 2.2.2.
- Начальное обучение погружения (тХерд день)
- Вставьте стартовый камеру. Заполните бак с водой (см 2.2.1.), Гарантируя, что уровень воды над отверстием в начальной области.
- Вставьте финишную зону и канальные делители для создания 5 плавательных каналов. Размещает горизонтальный кусок оргстекла сразу за пределами зоны старта, чтобы создать 5 см длиной дайвинг туннель.
- В течение третьего тренировки погружение крыса имеет окунуть голову под край начальной камере и плавать на 5 см под водой, чтобы достичь открытую воду плавательного канала. Дайте крысе затем продолжить плавание через лабиринт к финишной зоне.
ПРИМЕЧАНИЕ: После размещения в стартовой зоне, крысы инициировать собственную подводную погружение, и, таким образом, они считаются «добровольные» погружений. - Пусть крысы остаются в зоне финиша, по крайней мере 1 мин между испытаниями.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте внешний награду (то есть, еда) в ходе обучения, с тем, чтобы предотвратить активацию вознаграждения схем в мозге. - После отделки площадью периода ожидания, мягко держать крыс в течение 1 мин до начала следующего судебного разбирательства. Аккуратно высушите крыс с полотенцем в течение этого предварительного удержания.
- Повторите 5.3.3. через 5.3.5. для завершения 3 до 5 испытаний для каждой крысе обучаться в течение этого погружения тренировке.
- Удалите все канальные делители, начать камеру и закончить область из бака.
- Слива воды из бака. Смотрите 2.2.2.
- Еженедельная погружение график обучения
- Проводят ежедневный тренинги (см 5,3.) 5 дней в неделю, в идеале, в то же время каждый день.
- Начните первый судебный процесс с расстояния успешно провела переговоры в предыдущий день. Начните второй и третий испытания с увеличенным дайвинг расстоянии.
- С каждым последующим ежедневным тренировки увеличивают длину погружения туннеля путем добавления дополнительных горизонтальных разделителей для увеличения расстояния крысы должны плавать под водой. В течение первых нескольких тренировок увеличение Тхис расстояния 5-10 см. После крысы появляются более комфортно с дайвингом, увеличить расстояния 30-50 см.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не перенапрягать расстояние погружения попытки в течение последовательных испытаний. При необходимости поднимать до конца горизонтальной крышки канала, чтобы обеспечить более короткие расстояния погружения. Если в ходе судебного разбирательства погружения крыса не дойдете до конца погружения туннеля и начинает разворачиваться под водой, быстро поднимите конец крышки канала и позволяют крыса на поверхность и продолжить его плавать. Это позволит крысу, чтобы успешно завершить более длинное расстояние погружения. Это положительное подкрепление будет держать крысу двигаться вперед через подводный тоннель с каждой попытке погружения. - Используйте более значительное увеличение в расстояниях для дайвинга в то время как крысы учатся нырять прямую часть плавания канала. В отличие от этого, учится нырять вокруг крутых поворотов между каналами может занять 2-3 учебных занятий.
ПРИМЕЧАНИЕ: Часто во время ожидания в зоне финиша, крысы вновь войти гое вода, чтобы плавать, и / или погрузите их головы под водой в то время как до сих пор сидит на финиш площади платформы. - Повторите эту ежедневную протокол подготовки более 3 недель, чтобы обеспечить успешное плавание из целых 5 каналов. Это скучный протокол обучение обеспечивает успешное завершение лабиринт, тем более, что лабиринт включает чередующихся левых и правых крутых поворотов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полный 6 неделе график плавать и нырять обучение совпадает с ростом 35 г вновь отлученных крыс достичь веса в 300 г. - После ежедневных тренировки завершены, и крысы были возвращены в родную клетку, обеспечить крысы быстро высушить их мех через уход, или, если это необходимо, поместите грелку под их клетке держать крыс тепло, пока их мех не станет сухой.
6. Экспериментальные Вариации
ПРИМЕЧАНИЕ: Основная экспериментальная установка и животное обучение были описаны выше. Тем не менее, поведенческий тренинг только прovides модель, которая будет использоваться с другими экспериментальными методами, чтобы собрать данные, представляющие интерес. Основные протоколы были изменены, чтобы расследовать конкретные аспекты реагирования дайвинга. Примерами таких модификаций, а также некоторые соображения для сбора данных, использующих эти физиологические и нейроанатомической методы, приведены ниже.
- Имплантируемые телеметрические передатчики
- После завершения обучения, использовать имеющиеся в продаже телеметрических передатчиков для передачи пульсирующего артериального давления от купания и подводного плавания крыс. Получить местного одобрение IACUC для процедур, касающихся хирургии и послеоперационной восстановление. Выполните процедуры имплантации, предложенные компанией за передатчиком, и обеспечить полное восстановление после операции, прежде чем вернуться крысу в воду.
- Убедитесь, что антенна приема сигнала радио находится поблизости, когда крыса находится в воде.
Примечание: Вода ослабляет радиосигналы, и поэтому расстояние радиосигнал NEред путешествовать по воде становится ограничивающим фактором из размеров резервуара. - Используйте ручной антенный палочку, а не размера антенны крыса-клетки, чтобы следить за крысу, как она прогрессирует через лабиринт. Хранить палочка антенну в пределах 30 см от крыс, чтобы гарантировать, что радиосигнал не теряется в то время как крысы под водой.
- Продольный Канюли
- Редизайн канальные делители и горизонтальные части, создавая крышу тоннеля дайвинга, так что канюли тропы вдоль позади крысы во время его прохождения по лабиринту.
ПРИМЕЧАНИЕ: Модульная конструкция из каналов имеет первостепенное значение и должны также позволяют быстро восстановить крысы из подводного лабиринта. Если канюли коряги и стал выбили из крысы, крысы вскоре может истечь кровью, находясь под водой, если канюля не быстро вернули обратно. - Используйте заднюю артериальной канюли для регистрации артериального давления и частоты сердечных сокращений в добровольно дайвинга крыс. Используйте 90 см кусок РЕ50 какзавершающий канюли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это длина канюли достаточно длинными, чтобы подключить крысу к датчику давления, все еще позволяя крыса прогрессировать через лабиринт, пока достаточно коротким, чтобы свести к минимуму канюли мертвое пространство и достаточно близко к датчику давления, чтобы обеспечить достаточное верность артериальная сигнал давления. - Используйте задний венозный (или артериальной) канюли для введения лекарственных средств, таких как парасимпатической и симпатической агонистов и антагонистов, или вводить индикаторов или красителей, которые определяют распределение сердечного выброса.
- Вывод образцы крови у крыс с помощью венозной (или артериальной) канюли в то время как крысы под водой, чтобы определить, подводных уровней катехоламинов или биохимический анализ крови.
ПРИМЕЧАНИЕ: Минимизировать длину задней канюли и составляют канюли мертвого пространства во время забор крови.
- Редизайн канальные делители и горизонтальные части, создавая крышу тоннеля дайвинга, так что канюли тропы вдоль позади крысы во время его прохождения по лабиринту.
- Обнаружение активированных ствола мозга нейронов
- С помощью иммунологического обнаружения белка Fos, чтобы идентифицируетFY конкретные участки мозга, которые являются частью ответа дайвинга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время повторного инициирования кардиореспираторной рефлекса, ствола мозга нейронов, которые являются частью этого рефлекса цепи может стать активируется и производить белок, называемый Фо. - Повторно нырять крыс в лабиринте каждые 5 минут в течение 2 часов в общей сложности 24 погружений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие протоколы, которые также вызывают нейронов производство Fos также может быть использован. Чтобы избежать активацию нейронов ствола мозга, участвующих в ответ на стресс, что поведение повторяется, должны быть включены как часть поведенческого обучения.
- С помощью иммунологического обнаружения белка Fos, чтобы идентифицируетFY конкретные участки мозга, которые являются частью ответа дайвинга.
- Уровни в крови кортикостерона во Дайвинг
- Используйте кортикостерона в качестве индикатора уровня стресса крыс опыта во время купания и подводного плавания.
- Чтобы получить кровь для анализа кортикостерона, привлечь 0,1 мл пробы крови из хвостовой вены крыс через 15 мин после 3 добровольных плавает или ныряет.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительные эксперименты показали, что 15 мин является суfficient время для обеспечения производства и выпуска кортикостерона в обращении и вызвать пик плазменных уровней кортикостерона. Поскольку уровни кортикостерона у циркадный ритм, планировать все в крови привлекает в то же время суток и переписывался с сроках учебных занятий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешное завершение описанных процедур подготовки для плавания и дайвинга могут уменьшить стресс, испытываемый крыс при погружении под воду. Уровни в крови кортикостерона показывают, что повторяющиеся ежедневные тренировки уменьшает stressfulness связанный с добровольной дайвинга, и обученные крысы не найти дайвинг не более напряженный, чем обрабатывается ежедневно человеком (рисунок 2; 17). И наоборот, крысы не обученные в протоколе дайвинг найти добровольное дайвинг стрессовой (рисунок 2; 17). Кроме того, обе подготовленные и неподготовленные крысы находят вынуждены нырять быть самым напряженным (Рисунок 2; 17).
Сердечно-сосудистые реакции от плавания, добровольного дайвинга и вынужденных дайвинга крыс были записаны с помощью имплантированных устройств телеметрии (рисунок 3; 8,17-20) и заднюю канюли (рис 4; 21-23). Сразу же после добровольнойпогружение, и в пределах одного избили, уменьшается частота сердечных сокращений на 78% и среднее артериальное понижает давление на 25% 17. Эти результаты показывают, что добровольно водолазные крысы обладают теми же кардиореспираторных изменений, обычно наблюдаемым в других водолазных животных. Завершающие артериальные канюли были использованы для введения мускариновых антагонистов атропин, который исключает брадикардии, связанной с добровольным дайвинга (рисунок 4; 21), и, чтобы определить распределение сердечного выброса 22, в том числе мозгового кровотока 23, в ходе добровольного дайвинга. Завершающие канюли также были использованы, чтобы показать, что крысы игнорировать повышение артериального гипоксемии и гиперкапнии, пока они погружены 18, и что уже существующие хеморецептор диск не имеет никакого влияния на сердечно-сосудистую ответов на добровольной дайвинга 21.
Нейроны в пределах тонких пластин I и II брюшной мозговом заднего рога (МДГ) выразить Фос Даринаг добровольное дайвинг, и эти нейроны могут представлять собой начальную ствола мозга афферентный реле ответа дайвинг (рисунок 5; 24). Важные ствола мозга кардиореспираторной области управления, такие как хвостовой области прессорной (CPA), ядро Tractus одиночки (НТС), Ростральные вентролатеральный мозгового вещества (RVLM) и peribrachial регионы, все шоу увеличился Fos маркировки во время добровольного дайвинга сравнению с плаванием 25. Нейроны в chemosensitive регионах мозга выразить Fos после длительность вынуждены погружения 18.
Рисунок 1:. Схема дайвинга танк Оргстекло бак (100 х 60 х 15 см) был использован для создания простого лабиринт, состоящий из пяти длиной 1 м каналам. Бак был заполнен 30 ° C водопроводной водой, и крысы были первоначально обучены negotiatе лабиринт вплавь на поверхности воды, из стартовой зоны (слева вверху) на финише (внизу справа). Затем крыс обучают нырять через лабиринт, хранится под водой горизонтальных оргстекла штук помещается 2-3 см ниже поверхности воды. [Эта цифра была изменена с 26]
Рисунок 2: кортикостерона измерения. Кровь тянет из крысиных хвостовой вены были использованы для измерения концентрации кортикостерона (среднее ± SE) от крыс, оставшихся в своих клетках (наивные), крысы обрабатываются в течение 10 мин / день (Handled), крыс, обученных плавать и нырять (Обученные), и крыс что не получил плавать или нырять обучение (неквалифицированный). Кортикостерон измеряли после обученные крысы завершили свою плавать обучение (слева установлен баров), после обученные крысы завершили свою добровольную DIVе обучение (Центр множество баров), и после обученных крыс завершили свою вынужденную обучение погружения (правильный набор баров). 1 показывает, величина значительно больше, чем наивных; 2 показывает, величина значительно больше, чем обрабатывались; 3 показывает величина значительно больше, чем Квалифицированные; * Означает, что в Обученные значения крыс во время принудительного погружения значительно больше, чем во время добровольного погружения. [Эта цифра была изменена с 17]
Рисунок 3: артериальной следы артериального давления от телеметрических датчиков Сырье следы данные, показывающие, пульсирующего артериального давления во время плавания (левый столбец), добровольное дайвинг (средняя колонка), и принудительный дайвинг (правая колонка) от крыс, обученных плавать и нырять через лабиринт. (нижняя строка) и от крыс, которые не имели траиПроцедура нин (верхний ряд). Дайвинг подводная (добровольный и принудительный погружение) производится немедленное брадикардии и медленное начало увеличение артериального давления, в то время как плавание на поверхности воды не вызвало таких сердечно-сосудистых изменений. Бары под следами указывают периоды затопления. Перерывы в след указывают периоды, когда сигнал телеметрическая погиб. [Эта цифра была изменена с 17]
Рисунок 4: Атропин устраняет дайвинг брадикардии. Оригинальные записи пульсирующего артериального давления добровольно дайвинга крыс (А) до и (б) после атропина предварительной обработки. Следы были получены с использованием заднюю артериальную канюлю. Перед атропина предварительной обработки, артериальное давление несколько снизилось по погружению, но ткурица увеличился до более чем перед погружением на оставшуюся часть погружения. Частота сердечных сокращений определялась из смежных интервалов давления импульса. По погружения было немедленное и значительное брадикардия, что был поддержан на время погружения. После парасимпатической блокады атропином предварительной обработки брадикардия был ликвидирован. Был также увеличение артериального давления во время погружения. В баре под следа указывает период погружения. [McCulloch, неопубликованные]
Рисунок 5: Фос маркировка в МДГ. Микрофотографии тройничного мозговом заднего рога (МДГ) и спинного тройничного тракта (SP5) у крыс, обученных нырять под водой. (A) В контрольной крысы, которые не повторно нырять нет Фос маркировка. (B) В плывущей крысы там очень горитTLE Фос этикетки в МДГ (большая стрелка) или paratrigeminal ядро (маленькая стрелка) в sp5. (C) В водолазном крысы есть больше Фос маркировка вентрально как в МДГ (большой стрелкой) и paratrigeminal ядра (маленькие стрелки) по сравнению с плавание и управление крыса. Вставьте в панели (А) указывает на ростральной-каудальной расположение панелей переменного тока. Бар Шкала в панели C 100 мкм. [Эта цифра была изменена с 24]
Рисунок 6: Активированный катехоламинергических нейроны от дайвинга крыс. Микрофотографии показывают medullas из контрольной крысы без дайвинга (А, С, и Е) и добровольно дайвинг крысы (B, D, и F). Ткань мозга immunohistologically обрабатываются как для Фос апd тирозингидроксилазы (TH), производить коричневый TH Somas и черные ядра Fos. Открытые стрелки определить один-меченых TH-позитивных нейронов, в то время как сплошные стрелки определить Fos + TH двойные-меченных нейронов. A1 нейроны идентифицируют в А и В. С1 нейронов определены в C и D. A5 нейроны идентифицируют в Е и F. Более Fos и TH дважды меченного видны в A1, C1, и A5 регионы водолазного крысы, чем в не-дайвинг управления крысы. Бар Калибровка в Е для панелей AF, и составляет 250 мкм. Бар Калибровка в вставке F для всех вкладках, и составляет 50 мкм. [Эта цифра была изменена с 26]
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Крысы в их диком виде могут и эксплуатировать полу-водной среды, и будет часто нырять под водой в то время как в поисках пищи 6. Таким образом, это не слишком удивительно, что крысы могут быть очень легко обучаются добровольно нырять под водой. Описанные процедуры подготовки может длиться до 6 недель, которые будут приносить недавно отлученных крыс к размеру тела, используемой в большинстве атласов взрослых головного мозга крыс (~ 300 г). Таким образом, мозг из этих обученных животных будет более легко сопоставимы с анатомических структур, определенных в этих атласов.
После помещения в начальной области большинство крыс начнет свою подводную плавание в течение 20 сек. Тем не менее, иногда крыса может занять до 5 минут или более, прежде чем начинать свой добровольный погружение. Хотя это может быть заманчивым на данном этапе, чтобы заставить крыс в подводный туннель, это, как правило, следует избегать, чтобы предотвратить крыс от общения воду с отрицательным опытом. Грызуны могут быть упрямы и могут INITIсоюзником отказываются нырять во время учебных занятий, но как только они понимают, единственный способ выйти из воды является, заполнив погружение через лабиринт, они, как правило, инициировать их погружения в ближайшее время после помещения в стартовой зоне.
Одним из важнейших аспектов в повторяющихся и методических процедур подготовки является то, что они проводятся таким образом, чтобы уменьшить стресс, испытываемый крыс. Сдача крысы исследовать свое окружение, особенно в то время в завершающей зоне между испытаниями, кажется, еще больше снизить уровень стресса. Крысы часто повторно войти в воду, чтобы плавать, и / или погрузите их головы под водой в то время как до сих пор сидит на финиш площади платформы. Это говорит о том, что крысы не являются по сути вода отвращение. Кроме того, в то время как это не редкость для крыс, чтобы произвести фекальные шарики во время купания и подводного плавания, или когда, ожидающих в зоне финиша, ежедневные результаты обучения в меньшем количестве фекальных шариков 17. В целом меньше подвержены стрессу крысы являются в процессе обучения, тем меньше реllets они будут производить. Любые фекальные шарики, которые производятся удаляются из акватории или финишной как можно скорее, чтобы вода относительно чистая.
Крысы могут время от времени получать кровавые носы во время купания и подводного плавания, которые могут быть результатом вдувания воды в носовые проходы. Появление крови может быть связано с осмотическим напряжений в слизистой оболочке носа. В то время как в финишной зоне между испытаниях крысы будут ухаживать за собой. Как следствие крови из носа может получить перераспределяется на голову крысы и морды, давая крыс небольшое красноватый оттенок, особенно вокруг глаз, в ходе тренировки. Кроме того, иногда крыса может найти дайвинг стресс и / или имеют негативный опыт дайвинга (т.е., повернув вокруг и заблудиться во время погружения в воду (см примечание после 5.4.3. О том, как предотвратить это)). В этих крыс порфирина может появиться в углах их глазах, сигнализации стресс Responsе.
Размер бака водолазного будет до некоторой степени определять требования по комнате. Описанный бак предназначен иметь крысы плавать 2-3 см под поверхностью воды через 5 м оргстекла лабиринт, чтобы дать подводную продолжительность купания 10-15 сек 17,19,24,26,27. Если эксперимент будет предназначен для измерения ответы от более длительный срок погружения, или от более глубокого погружения под водой, бак, возможно, потребуется вновь разработанные. Требования номер мог тогда также измениться, чтобы соответствовать размеры вновь разработанные дайвинг танк. Если нет трап доступны в процедурной комнате, вода из резервуара могут быть собраны в большом контейнере, например в виде 60 гал мусора может, которые затем могут быть очищены в другом месте в удобной форме.
Техника Фос могут быть использованы с другими методами нейронов обнаружения в дальнейшем выявить и охарактеризовать нейроны, которые являются частью ствола мозга схемы ответа дайвинга. Например,Обнаружение Фос в сочетании с окрашиванием тирозингидроксилазы выявила Катехоламинергическая нейроны в А1, С1, А2, А5 и суб-голубоватого области (рисунок 6; 26) и globosa нейроны внутри боковой A7 области 26,27, которые активируются во время добровольной дайвинг. Кроме того, обнаружение Фос в сочетании с ретроградной индикаторного холерного токсина определила клеточных тел сердечных блуждающего двигательных нейронов во внешнем формирования ядра ambiguus, которые активируются во время добровольного дайвинга 20.
Исследование на центральную нервную интеграции кардиореспираторных ответов на погружений имеет важное значение для целого ряда причин 6,8,28. Ответ дайвинг позволяет животных, включая человека, чтобы оставаться под водой под водой без дыхания в течение длительных периодов времени. Ответ дайвинг представляет собой функциональную реорганизацию ствола мозга гомеостатического контроля, и демонстрирует один из самых мощных в годtterns вегетативных рефлексов, наблюдаемых у животных. Ответ дайвинг также могут быть важны клинически у людей в рамках trigemino-сердечная рефлекса, носоглотки рефлекса и / или синдрома внезапной детской смерти. Наконец, понимание нейронной цепи, которая существует в стволе головного мозга крыс поможет определить, как корковых афферентных сигналов может изменить основной ствола мозга вегетативные рефлексы. Все эти соображения делают изучение центральных аспектов млекопитающих ответ дайвинг сути стоит и интересно. Используя описанные процедуры тренироваться крыс добровольно нырять под водой позволит лучше исследовать центральных аспектов млекопитающих ответ дайвинг чем будет использование принудительных нырнул животных. Это потому, что процедуры подготовки, как описано 1) уменьшить активацию стресс схемы ЦНС, и 2) не активировать ЦНС вознаграждение схему, потому что внешние награды не используются.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автор является консультантом для Stoelting компания, и при условии, что общий дизайн и технические характеристики Маккалок Dive танкового лабиринт к ним в коммерческих целях.
Acknowledgments
Исследование поддерживается финансирование из Университета Управления Среднего Запада исследовательских и программ, финансируемых. Спасибо также Среднего Запада университет животных фондом и Эрик Уоррен.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCulloch Diving Tank Maze | Stoelting Company | 60139 | |
| 1 inch internal diameter tubing | Fisher | 14-169-63 | Used to fill or drain tank |
| Plexiglas rodent restraint device (Economy flat bottomed restrainer) | Braintree | FB-M/L | For forced dives |
| Telemetric transmitters | DSI | Model PA-C40 (270-0040-008) | Used to transmit pulsatile arterial blood pressure |
| Hand-held antenna wand | DSI | Model RLA 3000 (272-5007) | Used to ensure radio antenna is near to transmitter while rat is negotiating underwater maze |
| Intramedic PE50, 0.023" ID | Fisher | 14-170-12B | Used as trailing arterial cannula |
| N95 mask - Moldex #2300N Series | Fisher | 19-003-246D | Used to limit inhalation of rat allergens |
References
- Butler, P. J., Jones, D. R. Advances in Comparative Physiology and Biochemistry. Lowenstein, O. 8, Academic Press. 179-364 (1982).
- Butler, P. J., Jones, D. R. Physiology of diving birds and mammals). Physiol. Rev. 77, 837-899 (1997).
- Butler, P. J. Metabolic regulation in diving birds and mammals. Resp. Physiol. Neurobiol. 141, 297-315 (2004).
- Foster, G. E., Sheel, A. W. The human diving response, its function, and its control. Scand. J. Med. Sci. Sports. 15, 3-12 (2005).
- Lindholm, P., Lundgren, C. E. G. The physiology and pathophysiology of human breath-hold diving. J. Appl. Physiol. 106, 284-292 (2009).
- McCulloch, P. F. Animal models for investigating the central control of the mammalian diving response. Front. Physiol. 3, 1-16 (2012).
- Krogh, A.
- Panneton, W. M., Gan, Q., Juric, R. The rat: a laboratory model for studies of the diving response. J. Appl. Physiol. 108, 811-820 (2010).
- Lin, Y. C. Autonomic nervous control of cardiovascular responses during diving in the rat. Am. J. Physiol. 227, 601-605 (1974).
- Lin, Y. C., Baker, D. G. Cardiac output and its distribution during diving in the rat. Am. J. Physiol. 228, 733-737 (1975).
- Huang, T. F., Peng, Y. I. Role of the chemoreceptors in diving bradycardia in the rat. Jap. J. Physiol. 26, 395-401 (1976).
- Fahlman, A., Bostrom, B. L., Dillon, K. H., Jones, D. R. The genetic component of the forced diving bradycardia response in mammals. Front. Physiol. 2, 1-7 (2011).
- Blix, A. S., Folkow, B. Handbook of Physiology. Shepher, J. T., Abboud, F. M. , American Physiological Society. 917-944 (1984).
- Kooyman, G. L. Diverse Divers. 200, Springer-Verlag. (1989).
- MacArthur, R. A., Karpan, C. M. Heart rates of muskrats diving under simulated field conditions: persistence of the bradycardia response and factors modifying its expression. Can. J. Zool. 67, 1783-1792 (1989).
- McCulloch, P. F., Jones, D. R. Cortical influences on diving bradycardia in muskrats (Ondatra zibethicus). Physiol. Zool. 63, 1098-1117 (1990).
- McCulloch, P. F., Dinovo, K. M., Connolly, T. M. The cardiovascular and endocrine responses to voluntary and forced diving in trained and untrained rats. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 298, 224-234 (2010).
- Panneton, W. M., Gan, Q., Dahms, T. E. Cardiorespiratory and neural consequences of rats brought past their aerobic dive limit. J. Appl. Physiol. 109, 1256-1269 (2010).
- Chotiyanonta, J. S., DiNovo, K. M., McCulloch, P. F. Bilateral sectioning of the anterior ethmoidal nerves does not eliminate the diving response in voluntarily diving rats. Physiol. Reports. 1, (2013).
- Panneton, W. M., Anch, A. M., Panneton, W. M., Gan, Q. Parasympathetic preganglionic cardiac motoneurons labeled after voluntary diving. Front. Physiol. 5, 1-10 (2014).
- McCulloch, P. F., Ollenberger, G. P., Bekar, L. K., West, N. H. Trigeminal and chemoreceptor contributions to bradycardia during voluntary dives in rats. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 273, 814-822 (1997).
- Ollenberger, G. P., Matte, G., Wilkinson, A. A., West, N. H. Relative distribution of blood flow in rats during surface and submerged swimming. Comp. Biochem. Physiol. A. 119, 271-277 (1998).
- Ollenberger, G. P., West, N. H. Distribution of regional cerebral blood flow in voluntarily diving rats. J. Exp. Biol. 201, 549-558 (1998).
- McCulloch, P. F. Activation of the trigeminal medullary dorsal horn during voluntary diving in rats. Brain Res. 1051, 194-198 (2005).
- Panneton, W. M., et al. Activation of brainstem neurons by underwater diving in the rat. Front. Physiol. 3, 1-13 (2012).
- McCulloch, P. F., Panneton, W. M. Activation of brainstem catecholaminergic neurons during voluntary diving in rats. Brain Res. 984, 42-53 (2003).
- McCulloch, P. F. Globosa neurons: a distinct subgroup of noradrenergic neurons in the caudal pons of rats. Brain Res. 964, 164-167 (2003).
- Panneton, W. M. The mammalian diving response: an enigmatic reflex to preserve life. Physiology. 28, 284-297 (2013).
