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방법 논문

기본 종양 및 / 또는 전임상에 대한 관련 전이 및 치료제의 임상 개발의 전 생체 치료 응답

14.2K 조회수

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DOI:

10.3791/52157

⸱

2014년 10월 2일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Molecular Pharmacology and Chemistry Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 3Department of Radiology, Weill Cornell Medical College, 4Department of Medicine, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 5Department of Oncology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 6Department of Surgery, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

설립 암 세포주 및 이종 이식편은 지난 수십 년간 암 연구의 주류이었다. 그러나, 최근의 증거는 치료 반응이 크게 종양 세포 미세 환경에 의해 영향을 받는다는 의미한다. 따라서, 우리는 약물 개발을 목적으로 일차 종양 시료의 생체 외 분석을 개발 하였다.

초록

확립된 암 세포주의 분자 분석은 지난 수십 년 동안 암 연구의 주류였습니다. 세포 배양은 치료 민감도와 내성에 대한 직접적이고 신속한 분석을 제공합니다. 그러나 최근의 증거에 따르면 치료 반응은 암세포의 고유한 분자 구성에 국한되지 않고 오히려 전통적인 배양 방법으로는 요약할 수 없는 특징인 종양 세포 미세환경에 의해 크게 영향을 받습니다. 종양 이종이식편의 구현조차도 약물 전달/효능에 대한 풍부한 정보를 제공하지만, 인간 종양 내에서 발생하고 종양 반응에 큰 영향을 미치는 종양 세포/미세환경 누화(즉, 용해성 인자)를 포착할 수 없습니다. 이를 위해 우리는 전임상 및 임상 치료제 개발을 위한 치료 반응을 직접 평가할 수 있는 생체 외(fresh tissue sectioning) 기술을 개발했습니다. 이 기술은 치료 반응 전반에 걸쳐 종양 세포/미세환경 컨텍스트 내에서 조직 무결성과 세포 구조를 유지하여 약물 효능을 평가할 수 있는 보다 정확한 수단을 제공합니다.

서론

효과적인 암 치료제를 개발하는 것이 매우 어려운 것으로 입증되었습니다. 암 세포주와 종양 이식편 -뿐만 아니라 이종 절반 위에 세기 1,2,3 대한 암 연구에서 사용되어왔다. 현재까지, 약물 감수성 및 내성 둘 확립 암 세포주 및 이종 이식 환자 유래의 분자량 분석 (PDX)이 필수적이다. 그러나, 확립 암 세포주에서의 시험 화합물들은 생체 내 효능을 예측할 수없고, 특히 PDX 모델에서, 동물의 생체 내 연구에 대응하는, 매우 많은 비용과 시간이 소요된다. 이 모델 시스템, 종양 진행 및 치료 전략에 응답하여 네이티브 미세의 영향에 알리는 즉 무능력의 한계는 이러한 분석을 보완하기위한 추가 방법을 개발하는 연구 분야를 주도하고있다. 최근의, 높아진 관심은 환자 다치의 생체 분석으로 지급되는암 치료 반응은 암세포의 내재적 분자 조성물 단독이 아니라 오히려 크게 기존 배양 방법에 의해 효과적으로 요약 할 수없는 종양 세포 미세 환경 (6, 7) 기능에 의해 영향을 받는다는 인해 큰 이해 또는 이식편 4, 5 / 또는 PDX. 상기 컨텍스트의 생체 외 분석 (예. 인접한 주위 종양 세포 미세 환경의 영향)보다는 셀룰러 균주 8, 9의 생체 외 분석을보다 실용적 일차 종양 / 전이 섹션의 평가를 의미한다.

우리는 모두 환자의 기본 종양 (정밀 분리 된 신선한 조직 섹션 즉.) 및 관련 전이 (즉, 림프절)을 충실하게 응답에 알립니다 (IC50), 오프 대상 효과 생체 기술에 여기에보고하고 분자 수 있습니다 저항과 피드백 메커니즘의 분석. 치료 적 레이저 각막 절제의 또한, 상관 관계 분석바이오 마커 및 유전자 발현 프로파일 대 utic 감도 / 저항 (즉. 높은 약물 반응이 특히 생물학적 프로필을 가진 환자와 일치) 관심 실험 약물에 반응 할 가능성 환자를 확인하기 위해 수행 될 수있다. 다중 매개 변수 방식으로 생체 기술과 평가의 적용은 환자의 선택과 임상 결과의 전반적인 개선을 향한 움직임이다.

생체 내 치료 반응 분석은 암 치료제의 전임상 및 임상 개발의 표준 도구가 될 수 있고, 치료 개발 전략에 맞춤 의학의 접근 방식으로 단계로 구상된다.

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프로토콜

참고 : 환자 조직 조달이 제도적 검토위원회 (IRB)를 통해 권한이 부여 된 기념 슬로안 케터링 암 센터에서 Biospecimen 및 임상 프로토콜 (프로토콜 번호는 각각 09-121 및 11-041을) -approved.

1 조직 조달

  1. 환자의 기본 종양 / 전이 조달
    참고 : 현재까지,이 프로토콜은 수술로 제거 췌장, 위 및 유방 종양 유형뿐만 아니라, 같은 림프종 전이에 수행되었습니다.
    1. 멸균 유출 방지 컨테이너 내의 밀봉 및 살균 누수 방지 플라스틱 시편 가방에 병리학 부서에 택배 또는 공압 튜브 시스템에 의해 표본을 제공하기 위해 외과 팀을 직접. 더 포르말린 고정액으로 신선한 상태의 시료를 수송 할 수있는 외과 팀을 직접.
    2. 어느 것이 Inc의 멸균 기술을 사용하여 신선한 표본을 채취하기 위해 병리학 자 또는 병리학 지원을 직접층류 후드 멸균 장갑과 악기의 ludes 사용.
    3. 수술의 완성에서 30 분에서 엄격하게 유지된다 조달 시료의 채취 시간을 기록한다. 냉 허혈을 고려하여 효과를 고려,> 30 분 (18)의 감기 허혈성 시간 절제술에서 샘플을 채취하지 않습니다.
    4. 무균 환경을 유지하기 위해 층류 후드에서 1.0 cm (3)에 약 0.5 cm (3)의 일차 종양 표본을 제거하는 병리학 부서 담당자 직접. 가능하면, 전위 프랭크 중앙 괴사 (세포 사멸)를 피하기 위해 인덱스 병변의 주변부로부터 종양 조직을 선택한다.
      참고 : 괴사 조직은 다음 기준 중 하나에 의해 심하게 인식 할 수 있습니다 : 색상이나 조직의 창백 손실; 괴사 조직 부드럽고 무른 인 강도의 손실; 괴사 및 실행 가능한 조직 사이에 뚜렷한 경계.
    5. pathologi 직접성 또는 병리학 보조 진단 평가를위한 종양의 즉각적인 샘플링 초과 후 (수술 폐기)에 주변 조직을 제공합니다. 약 5 ㎖의 1 % 항생제 (페니실린과 스트렙토 마이신)를 포함하는 최소 필수 미디어 (MEM)의 포함 된 15 ㎖의 멸균 원뿔 원심 분리 관에 시료를 놓습니다.
    6. 사용 가능한 (예를 들어, 유방 절제 표본의 겨드랑이 꼬리 림프절)은 같은 크기 (0.5 cm 3 cm 3 내지 1.0)의 조잡한 포지티브 관련된 림프절 표본을 조달 일차 종양의 약물 반응과 비교하면. 일차 종양 표본 마찬가지로, 1 % 항생제 (페니실린 스트렙토 마이신)를 포함하는 약 5 ㎖의 최소 필수 매체 (MEM)의 함유를 15 ㎖의 멸균 원추형 원심 분리 튜브에 연결된 림프절 표본을 배치.
    7. 만약 즉 수술 표본 허가 (예를 들어, 유방 절제 표본)을, (주 종양에서 먼) 제거의 정상 조직 샘플 (크기,약 5 ml의 전송만을 목적으로 1 %의 항생제를 함유하는 최소 필수 매체 (MEM)의 함유를 15 ㎖의 멸균 원추형 원심 분리 관에서 통상 고밀도 / 섬유질 유방 실질)​​ 및 장소. 실험실 시설 이전에 따라,에 cryovial, '스냅'동결 및 저장에 '정상'표본을 전송 -80 C의 냉동고 ° 향후 분자 분석을 위해.
    8. 젖은 얼음에 모든 시편을 놓고 즉시 생체 신선한 조직 절편에 대한 실험실 공간으로 운반 할 것. 하지 부에게 정상적인 시료를 수행 아니라 미래의 분자 분석을위한 C의 냉동고 °에 -80 저장합니다. 미래의 분자 분석을 위해 -80 ° C의 냉동고에 cryovial, '스냅'동결 및 저장에 대한 기본 종양의 부분과 관련된 전이을 전송합니다.
  2. 임상 연구에서 조직의 조달 (예, 선택적 코어 생검 바늘 (CNB))
    참고 : 우리는 환자의 종양 조직을 얻을치료 시작 전 액세스 종양 전이 CNB을 거쳐 그들의 동의를 임상 프로토콜에 등록. CNBs는 현재까지 유방암, 한계 영역 림프종, 맨틀 세포 림프종, 전이성 paraganglioma, 자궁 경부 (편평 상피 세포) 및 난소 암 환자에서 수행되었다.
    1. 중재 방사선 또는 관련 부서로부터 임상 인력 함유 멸균 원추형 원심 분리 관을 전처리 코어 생검을 수행하고 15 ml의 시료를 배치 유무 약 5 ㎖의 1 % 항생제 (페니실린 스트렙토 마이신)을 함유하는 최소 필수 매체 (MEM)의.
    2. 젖은 얼음에 생검 표본을 놓고 즉시 생체 신선한 조직 절편에 대한 실험실 공간으로 운반 할 것.

단면 및 Vibratome 설정 재료의 2 준비

  1. 단면 용 재료의 제조
    1. AGA 4 g을 첨가하여 4 % 아가로 오스 용액을 만들기PBS 100 ㎖로 상승했다. 오토 클레이브 (주기 설정 : 액체, 121 ° C, 30 분, 평방 인치 당 15파운드)를 처음 사용할 경우, 사용하기 전에 솔루션을 제공합니다. 이후 용도를 위해, 아가로 오스는 RT에서 굳은 것을 염두에 각각 사용하기 전에 (30 초 간격으로 높은 열을) 액화 적절 ~ 25 ° C (즉, 따뜻한 터치)으로 냉각 전자 레인지에서 4 % 아가로 오스를 배치합니다.
    2. 비 영구적 인 조직 내장 매체로 4 % 아가로 오스를 사용합니다. 4 %의 아가 로스를 충분히 냉각하고 무균 집게 매립 금형 티슈 시편을 넣고 4 % 아가 로즈 부어와 액체 상태 여전히 때.
    3. 매립 금형의 절삭면의 벽에 직접 주변 조직 시료 (~ 2mm의 거리)를 배치 아니지만. 4 % 아가로 신속 고화하기 때문에 적절히 빠르게 조직 시편을 위치시킨다. 단면 동안 솔루션을 유지하기위한 55 ° C의 물을 욕조에 4 % 아가로 오스를 유지합니다.
    4. 단면 분석 24 웰 플레이트에 1 ㎖의 O 추가각 웰에 F 완전한 미디어 (즉, MEM + 10 % 소 태아 혈청 + 1 % 항생제). 단면의 기간에 걸쳐 RT (~ 25 ° C)에서 24 웰 플레이트를 유지합니다.
  2. Vibratome 설정의 준비
    1. 진동 마이크로톰을 사용하여, (10)에 칼날이 시험편에 접근하는 속도 [10 (2.5 mm / 초) 0 (0.00 mm / 초)]와 블레이드 [0 (0 Hz에서)의 주파수를 설정 (100 Hz에서) ]. 조직 (즉, 밀도 / 탄력)의 질감에 따라 설정을 조정합니다.
    2. 침윤성 암의 주요 유방 종양의 경우, 각각 6, 3, 속도 및 주파수 설정을 조정합니다. 밀도가 낮은 / 회사 종양 조직의 경우, 속도가 감소하고 그에 따라 주파수를 증가시킨다.
    3. (- 999 μm의 1) 기기의 범위 내에서 부분의 두께를 설정합니다. 이러한 분석의 경우, 200 μm의에서 단면 두께를 설정합니다.
    4. 시험편 디스크 그쪽에 액상 접착제의 얇은 층을 사용하여 아가로 포매 표본 마운트t는 젖은 얼음에 쌌다 미디어의 저수지에 잠겨있다.

3 조직 단면, 처리 및 분석

  1. 즉시 전체 미디어의 1 ml의 멀티 웰 플레이트에서 멸균 포셉과 장소를 사용하여 단면에 정밀 슬라이스 섹션을 제거합니다. 충분한 부분이 상호 반응 및 분석을 위해 획득 될 때, 표준 조직 배양 조건 설정 조직 배양 인큐베이터에서 치료 반응을 위해 멀티 웰 플레이트를 배치했다.
  2. 배양 아티팩트 반대로 용량 의존적 반응을 확인하기위한 노력으로 처리 된 부분 책꽂이 다중 제어부를 타고. (- 4 시간 ~ 2) 18도 차가운 허혈 시간의 해로운 영향에서, - (40 분 ~ 30) 조직 빠르게 단면을 수행합니다. 단지 1 시간의 순응 기간 다음 섹션의 치료를 수행합니다.
  3. 1 시간의 순응 기간에 따라, 용량 (치료 관련 증가 추가; 예, 0 - 치료 기간에 대한 표준 조직 배양 조건에서 섹션과 집으로 약물의 10 μM 농도). 이 연구를 위해 24 및 / 또는 48 시간 평가 기간을 사용합니다. 및 96 시간 평가 기간까지의 기간 동안, 본 연구에서 시험 그러나 제어 (차량 전용) 조직 섹션은 가능한 유지됩니다.
  4. 치료 후, RT O에서 10 % 포르말린과 장소를 포함하는 튜브에 조직 절편을 배치하여 멸균 조건 및 포르말린으로 고정 섹션이 모두 제거 / N 또는 4 % 파라 포름 알데히드를 함유하는 튜브 (유리 병에서 16 % 파라 포름 알데히드를 희석 2 시간 동안 RT에서 4 %의 최종 농도) 및 장소와 PBS.
    1. 큰 조직 섹션을 수정 (예. ~ 6mm X 4mm) 10 % 포르말린의 O에서 200 μm의 두께 / RT에서 N. 작은 부분을 수정 (예를 들면., 1mm X 1mm) 실온에서 2 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드에서 200 μm의 두께.
      NOTE : 정착액 (F)의 양을 효율적으로 침투ixative 조직의 부피를 20 배한다. 주어진 적절한 고정 사용하는 모든 조직의 크기에 정착 1 ㎖의 보증을위한 매우 작은 조직의 크기 (예를 들어, 6mm 3 조직 = 6 μL 볼륨),이 프로토콜의 결과.
    2. 고정 후 조직 표본은 병리학 부서 담당자가 포함 된 파라핀있다. 충전 슬라이드 위에 파라핀 블록 표본 섹션 헤 마톡 실린 및 스테인드 에오신 및 평가 면역 조직 화학적 (예를 들면, 세포 사멸) 할 수 있습니다.

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결과

이 연구를 위해 생체 외 기술은 열 충격 단백질 90 저해제 (Hsp90i)의 치료 감수성 / 내성 상관 분석에 사용 하였다. 이 Hsp90i, 유방암 일차 종양, ER + 침윤성 암종 (IDC), 및 관련된 림프절 전이의 임상 평가에 치료 반응을위한 생체 외 분석 하였다   (그림 1). 여러 200 μm의 시리얼 섹션 Hsp90i의 차량 만 증가 복용량 (0.25, 0.50, 1.0 및 2.5 μM)로 처리 하였다. 그림 1의 데이터는 포르말린에 고정 된 48 시간의 치료 기간에 따라 파라핀 (FFPE)와 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 염색 섹션을 나타냅니다. 핵 형태 학적 변화에 의해 볼 때 2.5 μM 처리 조직 절편은 세포 사멸의 40 % 유도 결과 반면 처리 부분 제어 (전용 차량) 가능한 IDC 둥지를 보여줍니다 (즉, pyknotic 핵 / APOPtotic ...

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토론

효과적인 치료 전략을 개발하려고 할 때 암 생물 학자들은 상당한 도전에 직면하고 있습니다. 확립 암 세포주에서 약물 개발을 테스트하는 것은 정확하게 생체 반응과 PDX 모델에서 생체 내 실험은 노동 집약적이고 비용이 매우 다를 수있다. 상기를 감안 기본 환자의 생체 기술의 애플리케이션 (15)은 현재 설정된 암 세포주와 환자 유래의 이종 이식 (PDX)의 분자량 분석 옆에 위치되는, 14 종양.

이 문서는 기술이 충실하게 응답에 (IC50)를 알려주는 것을에 새로운 높이로, 오프 - 타겟 효과를 생체 기술의 적용을 받아 저항과 피드백 메커니즘을 분자 분석을 할 수 있습니다. 응답 데이터는 종양 분자 프로필에 종양 몰 대 (즉, 단백질, 종양 바이오 마커의 발현, 돌연변이) 상호 연구 (응답 상관되면ecular 프로필) 환자의 결과를 개선하기위한 노력으로, 특...

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공개 사항

이해 상충은 공개되지 않았습니다.

감사의 글

저자는 MSKCC 조직 조달 서비스 팀(TPS), 특히 Maria Corazon Mariano, Priscilla McNeil, Anas Idelbi, Daniel Navarrete 및 Katrina Allen에게 이 프로젝트를 성공적으로 추진하기 위한 모든 노력과 5 R21 CA158609-02 및 Conquer Cancer Foundation 및 Breast Cancer Research Foundation의 자금 지원에 감사드립니다. 또한, 저자는 이 원고를 제출할 수 있도록 지원해 준 Office of Research and Project Administration, Office of Technology Development, Research Outreach and Compliance 및 RTM Information Systems Support의 부사장인 Eric Cottington 박사에게 감사의 뜻

을 전합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Vibratome Leica VT1000sLeica14047235613
UltraPure 아가로스Invitrogen16500500사용 전에 4%와 6%를 준비하십시오
. 주입기 블레이드Ted Pella121-4
MEM과 페니실린; + 스트렙토마이신미디어 코어 시설 (MSKCC)미디어는 Memorial Sloan Kettering Cancer Center에서 준비됩니다 
메스 번호 10Thermo Scientific31-200-32
일회용 집게Cole-Parmer84011182
Embedding mold전자 현미경 과학70181
FBS (불활성화)Gemini100106
24웰 플레이트Corning3524
포르말린(10%)Sigma DiagnosticsSDHT501128 
16% 포름알데히드 용액Thermo Scientific28908
임베딩 마이크로제트SimportM503-2
에탄올(70%)Fisher ScientificA405P-4
수조Fisher Scientific15-462-2SQ
마이크로파General ElectricModelJES2051DNBB
접착제(에틸 시아노아크릴레이트)Sigma-AldrichE1505-5G
10mm 접시BD 팔콘353003
15ml 튜브BD 팔콘352096

참고문헌

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