Une Ex Vivo Induite par laser Spinal Cord Injury modèle pour évaluer les mécanismes de la dégénérescence axonale dans en temps réel

Résumé

Nous présentons un protocole utilisant la microscopie time-lapse à excitation de deux photons pour visualiser simultanément la dynamique des lésions axonales et myélines en temps réel. Ce protocole proposé permet d’étudier les facteurs intrinsèques et extrinsèques qui peuvent influencer le destin des axones myélinisés centraux après une blessure et contribuer à une invalidité clinique permanente.

Résumé

Axones du SNC blessés ne parviennent pas à se régénérer et se rétracter souvent loin de l'endroit de la blessure. Axones épargnés par la blessure initiale peuvent subir tard dégénérescence axonale secondaire. L'absence de formation du cône de croissance, la régénération et la perte de projections axonales myélinisées supplémentaires au sein de la moelle épinière limite grandement la récupération neurologique après une lésion. Pour évaluer dans quelle centrale axones myélinisés de la moelle épinière répondent à des blessures, nous avons développé un ex vivo modèle vivant de la moelle épinière en utilisant des souris transgéniques qui expriment la protéine fluorescente jaune dans les axones et un foyer et des blessures de la moelle épinière induite par laser hautement reproductible pour documenter le sort des axones et la myéline (lipophile colorant fluorescent rouge Nil) au fil du temps en utilisant excitation à deux photons time-lapse microscopie. Processus dynamiques tels que lésion aiguë axonale, la rétraction des axones et la dégénérescence de la myéline sont les mieux étudiés en temps réel. Cependant, la nature non-focal de blessures, fondé contusion-et artefacts de mouvement a rencontréin vivo au cours de la moelle épinière de l'imagerie marque différencier les réponses de lésions axonales primaires et secondaires à l'aide de microscopie à haute résolution difficile. Le modèle ex vivo de la moelle épinière décrit ici imite plusieurs aspects de contusion / pathologies axonales cliniquement pertinentes induite compression y compris gonflement axonal, la formation sphéroïde, transection axonale, et péri-axonale gonflement fournir un modèle utile pour étudier ces processus dynamiques en temps réel. Les principaux avantages de ce modèle sont une excellente résolution spatio-temporelle qui permet la différenciation entre l'insulte primaire qui blesse directement axones et des mécanismes de blessures secondaires; perfusion contrôlée de réactifs directement au bain de perfusion le cordon; modifications précises du milieu de l'environnement (par exemple, le calcium, les ions sodium, contributeurs connus de lésions axonales, mais près impossible de manipuler in vivo); et des modèles murins offrent également un avantage car ils fournissent l'occasion de visualiser etmanipuler les populations de cellules génétiquement identifiés et structures sous-cellulaires. Ici, nous décrivons comment isoler et de l'image de la moelle épinière de souris vivant pour capturer la dynamique de lésions axonales aiguë.

Introduction

La dégénérescence des axones est une cause importante de morbidité couvrant plusieurs conditions neurologiques, y compris la neurotraumatologie, accident vasculaire cérébral, auto-immune, et les maladies neurodégénératives. Contrairement au système nerveux périphérique (SNP), système nerveux central (SNC) axones ont une capacité limitée de se régénérer une fois blessés en raison de deux obstacles intrinsèques et extrinsèques (ce est à dire, des molécules inhibitrices de la croissance axonale produite pendant la formation de cicatrice et libéré lors de la dégénérescence de la myéline) ^{1 -7.} Bien que plusieurs de ces obstacles ont été largement exploré, interventions thérapeutiques visant à prévenir CNS dégénérescence axonale, robuste promouvoir la régénération axonale, et restaurer connectively fonctionnelle, restent limités.

Axones fois séparés de leur soma subissent un processus stéréotypée de la dégénérescence connue sous le nom wallérienne dégénérescence qui se caractérise par un gonflement axonal, la formation et la fragmentation éventuelle sphéroïde (revue dans ^8). Encontraste, le moignon proximal qui reste dans la continuité avec le soma d'un axone périphérique sectionné, forme une enflure à son extrémité, meurt sur le nœud le plus proche de Ranvier, et peut alors initier la formation du cône de croissance, une condition essentielle nécessaire à la régénération axonale ultérieure ^9-11. En revanche, les terminaisons axonales proximales de nombreux axones centraux forment "endbulbs" caractéristiques ou des ampoules de rétraction, ne parviennent pas à former des cônes de croissance, et au lieu rétracter loin du site de la lésion où ils restent pendant des mois après une blessure ^12-15. En plus de la blessure axonale primaire, plus axonale dommages / perte peut également se produire aux axones qui ont été largement épargnés par la blessure initiale. Cette perte axonale tardive des axones initialement épargnées est appelée dégénérescence axonale comme secondaire. Cette réponse inhérente des axones du SNC d'une blessure rend la régénération axonale fonctionnelle un objectif encore plus difficile à réaliser dans le cerveau et la moelle épinière.

Bien hallmarks de lésions axonales (par exemple, la formation sphéroïde, ampoules de rétraction) ont été bien caractérisés à partir de tissus post-mortem et des modèles expérimentaux de dégénérescence axonale, l'élucidation des mécanismes moléculaires qui sous-tendent ces processus dynamiques a été restreint. La plupart de ces études se est appuyé sur les observations finaux statiques qui intrinsèquement échoué à capturer réponses axonales individuels au fil du temps. Bien appliquées de manière exogène traceurs axonales ont été utiles pour élucider réponses axonales des sections statiques et pendant l'imagerie en direct, la disponibilité de marqueurs axonales génétiquement codés a grandement amélioré notre capacité à visualiser axones en temps réel en utilisant la microscopie de fluorescence. En effet, un rapport séminal du Kerschensteiner et collègues ont d'abord fourni une preuve directe de la dégénérescence axonale et la régénération in vivo utilisant des souris Thy1 GFP-S qui codent pour une protéine fluorescente verte dans les sous-ensembles de neurones qui envoient leurs projections dans les colonnes dorsales de la moellecordon ^16. L'imagerie en direct approches utilisant deux microscopie à balayage laser de photons (TPLSM) et génétique fluorescente marquage des protéines de cellules d'intérêt continue de fournir une preuve directe et une approche mécanistique dans de nombreux processus dynamiques diverses telles que la dégénérescence axonale, Ca ²⁺ signalisation, la régénération axonale, astrocyte physiologie, la physiologie de la microglie, et la réponse à la blessure ^17-25.

Contrairement aux axones, on sait très peu de réponses de la myéline des blessures en temps réel. La myéline est une composante essentielle de la matière blanche produite et entretenue par les oligodendrocytes dans les cellules du système nerveux central et de Schwann dans le PNS. Myéline isole 99% de la surface des axones et, ce faisant fournit une haute résistance, faible capacité gaine protectrice qui soutient propagation de l'influx saltatoire rapide et efficace, a récemment examiné par Buttermore et al., ^26. Pour capturer la réponse dynamique de la myéline d'une blessure, nous utilisons le solvatochrome, lipophilecolorant fluorescent du Nil ²⁷ Rouge. Les propriétés de ce solvatochromes colorant vital permettent décalages spectraux de son spectre d'émission qui dépend de l'environnement physico-chimique ^28,29. Ces propriétés sont utiles pour mieux comprendre les mécanismes de blessure axomyelinic et peuvent être visualisées en utilisant convenablement choisis dichroïques et filtres d'émission ou résolus en utilisant la microscopie spectrale ^27. Par exemple, le spectre d'émission de rouge Nil est décalée vers le bleu dans des environnements moins polaires, riches en lipides tels que ceux trouvés dans les adipocytes et la myéline normale CNS (~ pic d'émission de 580 à 590 nm) ^27. En revanche, les pics du spectre d'émission de ce colorant vital à ~ 625 nm dans endbulbs formées comme des axones ²⁷ subissent un dépérissement axonale. Bien que les mécanismes précis qui sous-tendent ces décalages spectraux spécifiquement dans endbulbs contre la myéline normale restent floues, de telles modifications spectrales peuvent révéler des modifications sous-jacentes à l'accumulation de protéines ou de désorganisation conduisant àexposition des sites de liaison hydrophobes ^27.

Alors que l'imagerie in vivo est la métrique ultime pour observer la moelle épinière dynamique de lésions axonales dans leur environnement natif, il est techniquement difficile et nécessite une expertise chirurgicale importante, et répéter souvent chirurgies pour exposer la colonne dorsale qui peuvent introduire des artefacts expérimentaux (par exemple, l'inflammation et la cicatrice formation). En outre, un équipement coûteux est souvent nécessaire pour permettre la suspension et le positionnement d'un animal intact sous l'objectif de microscope. Les animaux doivent être soigneusement surveillés aussi bien pour se assurer qu'ils restent au chaud, pour assurer fluides sont reconstituées, et pour se assurer qu'il n'y a pas de signes d'hypoxie en raison de séances d'imagerie anesthésiés prolongées. Ce dernier point est extrêmement important que les axones et la myéline exigent absolument un niveau adéquat d'oxygène perfusion constante et de rester viable. Cependant, ce ne est souvent pas signalée ou contrôlée dans la plupart des études in vivo aujour. En outre, le mouvement artefacts dus à la fréquence cardiaque et de la respiration (isoflurane anesthésiés souris adulte: ~ 300-450 battements par minute (BPM) est optimale pour maintenir 97-98% de saturation en oxygène (normal taux ~ 632 BPM) et ~ 55-65 respirations par minute (taux normal est de ~ 163 respirations par minute), respectivement)) ³⁰ rencontrés lors in vivo moelle imagerie de cordon marque différencier les réponses de lésions axonales primaires et secondaires à l'aide de haute résolution microscopie à fluorescence difficile que même les plus rapides balayages laser inévitablement soumis à ces mouvements artefacts. Les progrès de la ultrarapides scanners résonance combinés avec un vertébrale rigide fenêtre encadrée implantable peut permettre l'imagerie de la moelle épinière de souris chez les animaux éveillés, mais les temps de numérisation plus rapide réduisent inévitablement le rapport signal sur bruit qualité d'image dégradants. D'autres améliorations dans les techniques d'imagerie de la moelle épinière comme actuellement utilisés pour l'imagerie cérébrale peuvent surmonter nombre de ces obstacles et de limiter les facteurs de confusion potentiels introduits par l'INAdequate perfusion tissulaire, par exemple, ^{de 31 à 33.}

Une grande partie de ce qui est connu à propos de White physiologie et mécanismes des lésions de la substance blanche question a été déterminée en utilisant in vitro ou ex vivo des préparations de la substance blanche du nerf optique, nerf périphérique, et des bandes de la moelle épinière substance blanche ^34-41. Ces préparatifs se poursuivent pour faire progresser notre connaissance des mécanismes de lésions de la substance blanche, car ils permettent des changements dans les facteurs environnementaux, de l'application contrôlée de médicaments et des réactifs, des évaluations fonctionnelles en utilisant électrophysiologie, et des observations de microscopie par fluorescence directs des axones et la myéline dans les tissus vivants contrôlés. Pourtant, certaines approches précédentes pour observer les axones de la moelle épinière bandes de colonne dorsale ou ventrale bandes de la substance blanche blesser inévitablement axones de surface lors de l'étape d'élimination qui peuvent influencer la réponse des axones près opposés. Afin de capitaliser sur les manipulations expérimentales ci-dessus et éviter d'endommager le vefibres ry objet d'une enquête, nous utilisons un modèle ex vivo col de l'utérus de la moelle épinière, car il empêche le contact direct de la face dorsale de la moelle. Ainsi, l'architecture de la pie-mère et les axones des colonnes adjacentes dorsales superficielle reste viable et imperturbable pendant l'isolement.

Nous décrivons ici une approche relativement simple qui permet la visualisation directe des axones myélinisés centrales car ils répondent dynamiquement d'une blessure focale en temps réel jusqu'à 8 - 10+ h après une blessure. La blessure de la moelle épinière (Lisci) modèle induit par laser permet la différenciation entre les mécanismes de lésions axonales primaires et secondaires que la lésion primaire (site d'ablation) reste spatialement limitées dans le temps. La chambre de l'imagerie en plein bain est accessible à une intervention thérapeutique, la livraison de réactifs et manipulations de l'environnement. Agents de protection axomyelinic putatifs peuvent être rapidement évaluées en temps réel par des observations directes contre des expériences longues et coûteuses impliquant processus de tissusING, le sectionnement, immunomarquage, capture d'image, et l'analyse et fournit donc un modèle de substitution utile pour évaluer les réponses aiguës et les manipulations de protection avant de tester les agents expérimentaux d'animaux vivants.

Protocole

NOTE: Toutes les procédures animales ont été réalisées conformément aux lignes directrices fixées par le comité soin et l'utilisation institutionnelle animale de l'Université de Louisville, en adhérant à la réglementation fédérale.

1. Préparation de faible Ca ²⁺ et 2 mM de Ca ²⁺ liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) perfusats

1. Préparer faible teneur en Ca ²⁺ (0,1 mm) C tampon 2x, 2x Ca normale ²⁺ (2 mm) Un tampon, et le tampon 2x Stock B comme décrit dans le tableau 1. Les solutions d'achat d'actions individuelles permettent de modifier le contenu d'ions (par exemple, faible ou nulle Ca2 ⁺⁾ et peut être stockée à 4 ° C pendant jusqu'à un mois.
2. Pour perfusion intracardiaque lors de la dissection, ajouter 100 ml de 2x faible teneur en Ca ²⁺ Stock C et 100 ml de 2x Stock B dans une bouteille de plastique pour faire faible teneur en Ca ²⁺ 1x aCSF. Mélanger et stocker une nuit à 4 ° C ou faire frais.
3. Pour perfusion ex vivo de la moelle épinière au cours imagING, ajouter 500 ml de 2x normale Ca ²⁺ Stock A et 500 ml de 2x Stock B dans une bouteille en verre de 1 L pour générer 1x aCSF. Mélanger et stocker nuit à la température ambiante ou faire des frais.
4. Ajuster le pH de tampons ACSF à 7,4. Tout en gardant l'aCSF à la température ambiante, placez le bas Ca ²⁺ aCSF sur la glace, puis bulle deux tampons avec du gaz carbogène (95% de O _2; 5% de CO ₂₎ pendant 30 minutes avant utilisation et en continu pendant la perfusion.

2. Préparation de Ex Vivo Chambre Imaging

1. Enveloppez une couverture chauffante (pas de coupure automatique) autour de la bouteille de aCSF et ajuster la chaleur à basse température / moyen.
2. Insertion d'une ligne de perfusion aCSF dédié dans la bouteille reliée à une pompe de perfusion et en ligne chauffage qui est commandé par une sonde de température du régulateur de température et de rétroaction bipolaire comme représenté sur la figure 1A.
3. Fixez un insert de platine du microscope plat (152 x 102 mm) à la 2-photon excitation / confvecinal platine du microscope équipé d'un récipient de déversement.
4. Placez une grande chambre de perfusion bain ouvert (L x P x H; 12 x 24 x 8 mm) dans le récipient de déversement d'accueillir et de fournir un flux continu de frais oxygénée aCSF à l'ex vivo de la moelle épinière (voir Figure 1B pour un ex appropriée imagerie in vivo conception de la chambre).
5. Connectez le port de sortie de métal de l'appareil de chauffage en ligne à la chambre ex vivo d'imagerie utilisant des tubes appropriés. Placez un tampon absorbant mince sous la chambre ex vivo d'imagerie pour aider à maintenir la température de la mémoire tampon / tissu lors de l'imagerie.
6. Respecter la chambre ex vivo d'imagerie au fond de l'insert conteneur de déversements / stade utilisant gommette amovible. La malléabilité du collant collant permettra à la chambre d'être ajusté selon les besoins pour assurer trajet de la lumière de l'objectif soit perpendiculaire à la surface du tissu. Si nécessaire, utilisez un niveau à bulle pour ajuster la chambre.
7. Fixer unsonde en ligne rétroaction température du dispositif de chauffage à proximité de l'entrée de fluide de la chambre et un tube d'aspiration en acier inoxydable reliée à une ligne de vide à la sortie de la chambre. Supports de bande magnétique et micropipette appropriée sont utiles à cet égard. Allumer la source de vide.
8. Tournez sur la pompe à perfusion de commencer à remplir la chambre d'imagerie avec aCSF oxygéné. Régler la pompe de perfusion à 1,5-2 ml par min.
9. Contrôler le volume de aCSF dans la chambre de formation d'image en ajustant la ligne de vide. Il est important qu'il y ait suffisamment aCSF dans la chambre de formation d'image afin de couvrir le segment de la moelle épinière et permettre distance de travail suffisant entre un objectif d'immersion de l'eau et la surface du tissu. Myéline et les axones peuvent être altérées si le segment de tissu ne est pas complètement immergé dans l'eau douce oxygénée aCSF leader artefacts expérimentateur induits.
10. Ajuster le contrôleur de température en ligne du dispositif de chauffage de sorte que la température de liquide de perfusion dans la chambre d'imagerie est proche de la température ambiante.

3. Dissection des adultes de la moelle épinière cervicale murin

1. Euthanasier un adulte âgé de 6 à 10 semaines Thy1 YFP souris transgénique (utilisation souche appropriée qui a expression de la protéine fluorescente dans des neurones ganglionnaires de la racine dorsale) par injection d'une dose excessive de l'anesthésie au pentobarbital de sodium (200 mg / kg) par injection intrapéritonéale.
2. Une fois sous le niveau approprié de l'anesthésie (par exemple, pas de réaction à pincement de l'orteil et la perte de réflexe de clignement), raser soigneusement la peau recouvrant la moelle épinière et le cerveau avec une tondeuse chirurgicales. Nettoyer la peau à l'aide de la bétadine et plaquettes éthanol 70%.
3. Vaporiser le buste / abdomen avec 70% d'éthanol, puis perfuser le sujet transcardiaque utilisant réfrigérés, carbogène-barboter faible teneur en Ca ²⁺ aCSF. (Voir la figure 1C pour suggéré banc de dissection supérieure mis en place).
4. Comme le foie ne est rien, fixer l'aiguille de perfusion dans le coeur en utilisant un petit clip. Tourner le sujet au cours d'accéder à la face dorsale rasée dele sujet et essuyez la zone rasée avec 70% d'éthanol.
5. Faire une incision de la peau dorsale le long de la ligne médiane à partir de nez à la hanche avec des ciseaux de dissection pour exposer le cerveau et la colonne vertébrale (figure 2A). Fixer la préparation en plaçant broches au niveau du nez et de jarret.
6. En utilisant un microscope de dissection partir de ce point, bien couper à travers la surface dorsale du crâne au niveau des bulbes olfactifs. Insérez l'un des conseils de ciseaux dans les bords latéraux de l'incision et couper le long des bords de la calotte bilatéralement jusqu'à ce que le cervelet.
   REMARQUE: Ne pas exciser complètement la calotte comme il est nécessaire plus tard pour soulever le tissu recouvrant de la moelle épinière à travers la dissection (voir la figure 2B).
7. Soulevez la calotte d'exposer le cerveau. Couper délicatement les bords gauche et droit de l'os interpariétal (situé au cervelet) et le tirer en arrière pour exposer caudale du tronc cérébral / moelle épinière (figure 2C ).
8. Utilisez des ciseaux fine pointe de détenus à un angle de 45 ° par rapport à la surface de la table et couper les vertèbres bilatéral juste inférieur aux racines nerveuses postérieure.
   REMARQUE: Eviter le contact avec les colonnes dorsales blanches lumineuses. Ces fibres sont ceux qui seront imagés (Figure 2D) et peuvent être facilement endommagés.
9. Soulevez la surface de la calotte et dorsale de la colonne vertébrale avec pince fine à pointe, en tirant doucement le tissu recouvrant en une seule pièce que les coupes sont faites pour exposer la moelle épinière. Continuer à couper vertèbres au niveau thoracique supérieure pour isoler un segment de 1-2 cm de la moelle cervicale pour l'imagerie ultérieure (figure 2E).
10. Utilisez des ciseaux pour couper le tissu / os parallèlement à la colonne vertébrale et les tissus clair sous la colonne. Faire ces coupures que le niveau que possible. Il est très important que le tissu se trouve à plat dans la chambre de manière que le cordon soit au niveau de l'imagerie.
11. Utiliser un scalpel # 11 à sectionner le tronc cérébral (au-delà ducessation des fibres de faisceau gracile) et au niveau thoracique supérieure pour isoler le segment cervical de la moelle épinière (Voir Figure 2F). Utilisez des ciseaux pour couper le tissu / os à ces deux mêmes points. Le tissu isolé devrait contenir 2/3 de la colonne vertébrale qui englobe le tronc cérébral caudal, l'élargissement du col, et la moelle épinière thoracique supérieure (figure 2G).
12. Placez la colonne vertébrale isolée dans une boîte de Pétri de carbogène-barboter, faible teneur en Ca ²⁺ aCSF réfrigérés. Si nécessaire, couper le tissu en dessous de la colonne vertébrale jusqu'à ce qu'il repose à plat dans le plat.
13. Transférer la colonne vertébrale isolée à la chambre d'imagerie ex vivo et augmenter progressivement la température de perfusion en 1 heure à 36-37 ° C. Maintenir cette température pendant l'imagerie.

4. Le placement des ex vivo de la moelle épinière en imagerie Chambre et myéline marquage avec du Nil Rouge

1. Fixez soigneusement la colonne vertébrale dans le ichambre de forgemagie d'une tranche raccord approprié maintenez enfoncée modifié avec une plate-forme de grille verticale composée de fins fils de lycra (retirer les fils moyen de plate-forme de grille pour laisser place à la moelle épinière; voir la figure 3A).
2. Décongeler une aliquote de rouge Nil (5 mM dans du DMSO et 0,22 um filtré; peuvent être stockées pendant 1 mois à 4 ° C ou 6 mois à -20 ° C dans l'obscurité). Juste avant l'ajout de rouge Nil à la chambre de formation d'image, de réduire le débit de la pompe de perfusion et d'ajuster la ligne de vide pour assurer le fluide dans la chambre recouvre toujours la moelle épinière.
3. Ajouter 5-10 ul rouge Nil solution stock à la chambre d'imagerie près de l'extrémité caudale du cordon (figure 3B). Utilisez un 1 ml pipette pour mélanger doucement rouge Nil dans toute la chambre. Laisser rouge Nil de rester dans la chambre pendant 1-2 min, puis placez ligne de vide en arrière et régler la pompe de perfusion à 1,5-2 ml par min pour perfuser constamment la moelle épinière.
4. Soulevez avec précaution la platine du microscopeet aligner l'objectif avec le centre du segment de la moelle épinière et en dedans sur les colonnes dorsales jusqu'à ce que l'objectif à immersion dans l'eau est d'environ 10 mm de la surface de la aCSF dans la chambre. Utilisez le microscope roue nez de mise au point porter lentement l'objectif jusqu'à ce qu'il touche légèrement la surface de la aCSF. Utilisez une source de lumière épifluorescente de concentrer les colonnes dorsales dans le champ de vision (figure 3C).

5. imagerie ex vivo de la moelle épinière de souris avec TPLSM et induite par laser Spinal Cord Injury (Lisci)

NOTE: La veine postérieure fournit un marqueur utile de centrer le tissu que les fibres de faisceau gracile (proviennent de corps cellulaire des ganglions rachidiens et monter de T6 et ci-dessous le long de la ligne médiane de la moelle épinière) se étendent parallèlement à ce vaisseau sanguin. Les plus épais YFP + cervicales projections de racine dorsale fournissent également un marqueur utile que les fibres montent et descendent latéralement au YPF + faisceau gracile fibres qui sont plus petites en diamètre.

1. Une fois le tissu de la moelle épinière est aligné correctement, passez en mode de balayage laser pour effectuer l'imagerie de base des fibres myélinisées de faisceau gracile ascendant. Pour exciter les deux YFP et rouge Nil, utiliser une source laser à deux photons réglé à 950 nm de longueur d'onde (~ 17 mW mesurée à la sortie d'un 25X, 1,1 objectif NA) et dichroïques appropriés (DM) et les filtres passe-bande pour isoler l'émission fluorescente des fluorophores (nous utilisons 525/50 DM560, DM640 600/60, 685/70 et, pour séparer la YFP et rouge Nil en jaune-orange, et étendus canaux rouge, respectivement).
   1. Si plus de 3% des axones montrent sphéroïdes axonales lors de l'imagerie de base (30-60 min), jeter la préparation en raison d'artefacts induite expérimentateur.
2. Induire une Lisci en grossissant le champ de vision à 30.3X (pour créer un diamètre ablation ~ 20 um). Accorder le laser à 800 nm, et d'augmenter la puissance du laser de 110 mW à ~l'échantillon. Autoriser 5 champ complet de balayages laser vue d'assurer fibres sont complètement sectionnés.
3. Confirmez Lisci en modifiant les paramètres de laser aux paramètres d'imagerie (950 nm, 17 mW à l'échantillon, 2.08X) et numériser le tissu de visualiser l'ablation. Vérifiez que le diamètre de l'ablation et que les axones ablation primaires sont complètement sectionné (voir la figure 3D). Utiliser les paramètres time-lapse sur le microscope combiné avec z capture pour enregistrer la réponse dynamique des axones et la myéline d'une blessure jusqu'à 8-10 + h après une blessure.
   NOTE: Si l'ablation est incomplète (ie, transection incomplète de fibres), jeter la préparation, que la détermination des mécanismes de blessures primaires et secondaires seront confondus. En outre, des segments isolés de la moelle épinière peuvent être imagés jusqu'à 24 heures après l'Lisci avec seulement légère à modérée des lésions tissulaires Lisci indépendant.

Résultats

Détails d'un laboratoire approprié mis en place nécessaire d'isoler, de maintenir la viabilité, et l'image l'ex vivo de la moelle épinière est montré à la figure 1. Le microscope doit être équipé d'un laser accordable pulsé femtoseconde, dicroics appropriées et filtres d'émission et une eau trempage objectif avec une ouverture numérique élevée (≥1.0). Pour assurer la viabilité de la moelle épinière lors de la dissection, la procédure doit être effectuée en présence d'oxygéné refroidi bas Ca2

Discussion

Nous décrivons un procédé d'imagerie ex vivo de la moelle épinière axones myélinisés (c.-à faisceau gracile) associée à une lésion de la moelle épinière induite par laser pour étudier la progression dynamique de dégénérescence axonale myélinisées fois primaire et secondaire dans le temps. Imagerie ex vivo de la surface de la moelle épinière à bout de bien des complications associées à l'imagerie in vivo tels que les artefacts de mouvement et le potentiel de l'hypoxie indui...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Grande chambre de bain avec supports de tranche	Warner Instruments	RC-27L	Pour chambre d’imagerie ex vivo
Supports de tranche standard	Warner Instruments	SS-3	Pour chambre d’imagerie ex vivo
Maintien de tranche en plastique pour chambres RC-27L et RC-29	Warner Instruments	SHD-27LP/10	Pour chambre d’imagerie ex vivo
Tube d’aspiration, série 20 Design classique, gaucher	Warner Instruments	ST-1L	Pour chambre d’imagerie ex vivo
Solution Chauffage/refroidisseur en ligne	Warner Instruments	SC-20	Pour réguler la température du perfusat pendant l’imagerie
Contrôleur de température bipolaire	Warner Instruments	CL-100	Pour réguler la température du perfusat pendant l’imagerie
Système de refroidissement liquide	Warner Instruments	LCS-1	Pour réguler le perfusat température pendant l’imagerie
Ensemble de câbles pour contrôleurs de chauffage	Warner Instruments	CC-28	Pour réguler la température du perfusat pendant l’imagerie
Thermisiteur à billes de rechange pour le câble CC-28	Warner Instruments	TS-70B	Pour réguler la température du perfusat pendant l’imagerie
Support magnétique avec tube d’aspiration	Bioscience Tools	MTH-S	Pour maintenir l’aspiration sous vide en acier inoxydable tubing  ;
Support réglable	Bioscience Tools	MTH	Pour maintenir la sonde de température
mastic			Pour la superglue
			d’imagerie ex vivo Pour la chambre d’imagerie ex vivo
Fines			Pour la chambre d’imagerie ex vivo
rouge nil	Life Technologies	N-1142	Pour l’étiquetage de la myéline

silicone transparent de la chambre bandes de plexiglas