Summary
נפשית מראש איסכמי מרחוק (RIP) הוא שיטה של רקמות אוויר נגד לחץ מזיק. הקמנו שיטה של איסכמיה מרחוק בגפיים האחורי, על ידי ניפוח שרוול מד לחץ דם למשך 5-10 דקות. יכולות ההגנה העצביות של RIP הוכחו במודל של ניוון רשתית במכרסמים.
Abstract
איסכמיה sublethal מגנה על רקמות מפני איסכמיה לאחר מכן, חמורה יותר באמצעות גברת הביטוי של מנגנונים אנדוגניים ברקמה הפגועה. איסכמיה sublethal גם הוכחה upregulate מנגנוני הגנה ברקמות מרוחקות. תקופה קצרה של איסכמיה (5-10 דקות) בגפיים האחורי של יונקים גורמת תגובות של הגנה עצמית במוח, הריאות, הלב והרשתית. ההשפעה ידועה כנפשי מראש מרוחק איסכמי (RIP). זוהי דרך טיפולית מבטיחה להגן על איברים חיוניים, וכבר נמצאה בניסויים קליניים לפציעות לב והמוח. פרסום זה מדגים שיטה מבוקרת, פולשנית של קבלת איבר - במיוחד הגפיים האחורי של חולדה - איסכמי. שרוול לחץ דם שפותח לשימוש בילודים אדם מחובר למד לחץ דם ידני ומשמש להפעלת לחץ מ"מ כספית 160 סביב החלק העליון של הגפיים האחורי. בדיקה נועדה לזהות טמפרטורת עור משמשת כדי לוודא ischemi, על ידי הקלטת הירידה בטמפרטורת עור נגרמת על ידי חסימה נגרם לחץ של עורקי הרגל, והעלייה בטמפרטורה העוקבת שחרור של השרוול. שיטה זו של RIP מקנה הגנה לרשתית העכברוש מפני נזק הנגרם על-אור בהיר וניוון.
Introduction
הישרדותם של רוב, אולי כל, רקמות לנוכח לחץ מטבולים ניתן לשפר על ידי אוויר מראש עם תקופה של איסכמיה sublethal 1,2. נפשית מראש איסכמי (IP) במונחים מעשיים הוא החשיפה של רקמה לאיסכמיה sublethal, לפני חוויות רקמת לחץ חמור יותר, כגון עלבון איסכמי שלאחר מכן. במודלים של בעלי חיים, IP מספק הגנה מדהימה למוח, הרשתית, לב וריאות 3-6. במקביל, תצפיות בחולי שבץ מוחי הראו קשר בין פיגועים הקודמים איסכמי חולפים ותוצאות קליניות טובות יותר 7,8. IP גם מגן קולטני האור ברשתית מפציעות שאינן איסכמי 9.
היעילות של IP ברקמות ופציעות שונות מצביעה על כך שהוא מפעיל מנגנון מולד של תא הישרדות נוכחת בכל הרקמות. נפשית מראש איסכמי של שריר הלב כבר הציע לי השפעות מגנות דרך upregulationשל גורם היפוקסיה מושרה (HIF), ידוע להסדיר רבים מסלולים מטבוליים באמצעות שחרור אדנוזין או באמצעות פתיחת ערוצי אשלגן ATP במיטוכונדריה 10,11. ערוצי שחרור אדנוזין ואשלגן ATP הם מעורבים באיסכמיה מוחית אבל, חקירות מנגנוני ההגנה העצביות של אוויר איסכמי עד כה התמקדו בשינויים באנטי-הפעלת יתר רעילה, מסלולים אנטי-אפופטוטיים ואנטי דלקתיים 12,13. בסך הכל, הבנה של התהליך המולקולרי של אוויר להגנה על תאי עצב איסכמי היא מוגבלת.
ניסיונות נפשית מראש איסכמי מרחוק להתנות איברים מרוחקים חשובים ביותר (לב, מוח, ריאות) על ידי יצירת איסכמיה ברקמות פחות קריטיות. נפשית מראש מרחוק איסכמי (RIP) באמצעות הגפיים האחוריות הודגם להיות neuroprotective במודלים של מכרסמים של שבץ 14-17. השיטה שתוארה על ידי מספקת prot פשוט, אמין ולא פולשניocol גרימת RIP.
הרוב המכריע של פרוטוקולי RIP כרוך הגפיים האחורי, כנראה משום שעורק הירך ממוקם בגפיים האחורי העליונים ניתן לזהות בקלות והגישה להידוק כירורגית ויישום חוסם עורקים. במחקרי איסכמי איבר פולשני לחקר המוח והגנת עור, איסכמיה מושרה על ידי הפרדת עורק הירך מרצועות המפשעה ומהדק את עורק הירך 2,15,18.
איסכמיה כתוצאה מהידוק עורק או כבילת איבר או הירך אושרה על ידי שינויים באיבר כולל אובדן של דופק, ירידה בחמצון וירידה בטמפרטורת עור. איסכמיה מרחוק יכולה להיות מאושרת על ידי האובדן של דופק באמצעות דופלר לייזר או דופלר אולטרה סאונד 17-19. טמפרטורת עור יכולה לשמש כחלופה לדופלר למרות מערכת היחסים היא אינו ליניארי 20,21. הקלטות טמפרטורה מדויקות הן דבר שבשגרה במעבדות ופחיתלהיות משולב בקלות לתוך מחקרי איסכמי מרחוק.
אלטרנטיבה לירך מהדקת ניתוח היא האינדוקציה של איסכמיה באמצעות חוסם עורק. יישום חוסם עורקים מייצר איסכמיה דומה לזה שהושג עם הידוק כלי; Kutchner et al. לעומת עורק הירך פולשנית מהדק לחוסם עורק שאינו פולשני ומצא שני השיטות הופסקו זרימת דם לאיבר ונזק לעור מופחת במודל ניתוח פלסטי של איסכמיה דש עור 18. איזוק או הרגל או זרוע והעלאת לחץ השרוול לעיל לחץ דם הסיסטולי נמצא להיות מגן מפני נזק איסכמי בחזירים ובני אדם 17,19,22.
חוסם עורקים גישות שונים לגרימה מרוחקת איסכמי כולל שימוש בשרוול לחץ דם או 17,22,23 גומייה. עם זאת, השימוש בגומייה כדי לגרום לאיסכמיה הוא שיטה בטוחה, פוטנציאל עלייה נותנת לסכום מוסדר של לחץ באיבר, עם עליות בלחץ מעל 500 מ"מ כספית מוקלט בבני אדם 24. יתר על כן, איסכמיה האיבר באמצעות גומייה מובילה לנזק לשרירים בחולדות לאחר הסרת הלהקה 23, כפי שהוערך על ידי אוונס הכחול צבע, סמן vivo של חדירות myofiber 25. לעומת זאת, משלוח של לחץ מבוקר לחוסם העורק יכול להיות מושגת באמצעות שרוול לחץ דם קשור ל17,19,22,26 מד לחץ דם.
במחקר זה, מודל פציעה קל של ניוון קולטי האור שימש כדי להדגים את היעילות של נוירו נפשית מראש איסכמי מרחוק. איסכמיה מרחוק הייתה מושרה באופן מיידי לפני פציעה קלה, ומנעה ניוון קולטי האור הבא כפי שאושרה על ידי בדיקת תפקוד רשתית. הווידאו הנלווה ידגים את היישום של איסכמיה המרוחקת לא פולשנית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרת אתיקה: הפרוטוקול כדלקמן הנחיות טיפול בבעלי החיים של אוניברסיטת סידני, AEC # 5657. אלחוש אושר על ידי ועדת אתיקה של בעלי החיים (אוניברסיטת סידני, # AEC 5657).
1. הכנת ציוד
- להשתמש במעקב טמפרטורת עור בזמן אמת. לעבור על מחשב, וחומרת רכישת נתונים.
- תוכנת הטמפרטורה להרחיב הקלטה ולהתאים את הגדרת טמפרטורה לבין 30-35 מעלות צלזיוס ותדירות דגימה לכל 100 אלפית שניים.
- אופציונאלי: מדחום רקטלי הכנס על מנת להבטיח טמפרטורת ליבה נותר יציב ב37.5 מעלות צלזיוס.
2. כיול של המד לחץ הדם הידני
- חבר שרוול זרוע ילוד לsphygmomanometer.Use גודל 2 שרוול לחולדת 250-550 גר '. מתאם ייתכן שיהיה צורך לחבר את צינורות שרוול למד לחץ הדם.
- להוציא את האוויר השרוול או על ידי התרופפות שסתום שחרור אוויר או ניתוק צינורות שרוול מלהתאיםאו. להבטיח שאין לחץ נשאר בצינור ואת מחט מד הלחץ מוטלת על אפס בתוך האליפסה / המלבן.
- בדוק את הלחץ בין צינורות, מד לחץ ושרוול. לנפח את השרוול עם משאבות עדינות של הנורה האינפלציה עד שקורא על מד הלחץ 100 מ"מ כספית. ודא לחץ נשאר קבוע. להוציא את האוויר השרוול ידי פתיחת ערך שחרור האוויר לאט.
3. הכנת בעלי החיים
הערה: בעלי חיים, כי הם לעבור פציעת אור דורשים adaption הכהה בלילה שלפני איסכמיה מרחוק. בעלי חיים עוברים נזק קל דורשים גידול (אור 12 שעות: מחזור כהה (5 סוויטה דה לוקס)) אפל
- בצע איסכמיה המרוחקת בשני מכרסמים ער או anesthetised. ודא שיש לי חיות טונוס שרירים בריאים. להבטיח זאת על ידי צביטת הגפיים האחורי העליונים כדי לאשר יש הווה שריר נאות. הגנה מושרה RIP מפני פגיעת אור נבדקה בחולדות בישיבה עד גיל 6 חודשים.
- הכנת anesthetised לRIP
- הזרק חולדות עם זריקת intraperitoneal של 60 מ"ג / קילוגרם קטמין ו -5 מ"ג / קילוגרם xylazine. בדוק את עומק ההרדמה על ידי הרחבת הרגל וצובט את העור בחלק התחתון של כף הרגל. יש בעלי החיים לא רפלקס אם הוא anesthetised עמוק. החל דמעות מלאכותיות כדי למנוע יובש בקרנית תוך תחת הרדמה.
- מניחים חולדות בשתי כרית חום או במחזור צינורות דוד כדי לשמור על טמפרטורת גוף קבועה של 37.5 מעלות צלזיוס. מקם את העכברוש במצב שכיבה עם כריות כף הרגל של הגפיים התחתונים פונות כלפי מעלה. ימין או שמאל האיבר עשוי לעבור איסכמיה מרחוק.
- הכנה ערה לRIP
הערה: ער ניסויים בבעלי החיים דורשים שני אנשים. אדם אחד מרסן את החיה והאדם השני מפעיל את מד לחץ דם הידני. הנסיינים חייבים להיות בטוחים כדי לבצע את ההליך כאיפוק מעלה את הסיכון לפגיעה במפעילים. החולדות שעברו איסכמיה מרחוק חייבת להיות מותנות to איפוק במדריך. בהתאם להנחיות האינטואיטיבית איפוק במדריך צריך להיות התקדמות מ 30 שניות עד למקסימום של 5 דקות על פני מספר השבועות. בעלי חיים ביישנים שלא מצליחים להסתגל לריסון ספר צריכים להיות מחוץ ניסויים ער. לבסוף, איפוק ידני עשוי לגרום ללחץ (ואפשרות להציג את בלבול למחקר) לבעלי חיים ומחזור דמה (מיקום של שרוול ללא דלקת) יש להשתמש כדי לפרש במדויק תוצאות מחקר RIP.- חותך מגבת לתוך 15 סנטימטרים x 30-50 סנטימטר ומניח חתיכת הקצה הקצר בניצב לעמוד השדרה של החולדה, כיסוי הראש לראש הגפיים האחורי.
- לתחוב את הקצה הקצר מתחת לגופו של העכברוש בחוזקה ומתחיל לעטוף את העכברוש עם הקצה הארוך הנותר של מגבת. אבטח את בעלי החיים עטופים תחת הזרוע במצב שכיבה. אם החולדה מוחזקת ביד השמאל, לשחרר את האיבר תקין של החולדה מהמגבת.
o 4. יישוםבדיקה טמפרטורת עור F
- הארך את הרגל של העכברוש שהוא לעבור איסכמיה ולמקם את הבדיקה העור על השודד. מקם את הבדיקה העור למקסם את הקשר בין הבדיקה הטמפרטורה והעור. בתוקף לדחוף את החללית לשודדת הדרכים ולהדביק את החללית עם קלטת נייר.
- בדוק את מיקום הבדיקה עור על ידי מעקב הטמפרטורה בתוכנת הקלטת טמפרטורה. ודא שטמפרטורת העור היא בין 30-34 מעלות צלזיוס ונשארה יציב. עקוב אחר טמפרטורת העור במשך 1-2 דקות. התאם את הבדיקה העור אם הטמפרטורה היא יציבה או מתחת ל -30 מעלות צלזיוס.
5. איסכמיה מרחוק
- להוציא את האוויר השרוול ולהבטיח את שסתום לחץ האוויר סגור. הארך את הרגל ורופפת להקיף את השרוול על הגפיים האחורי העליונים. השתמש באצבע והאגודל להאריך את הרגל ואת הספרות נמוכה יותר כדי לשמור על השרוול הרופף בעמדה.
- להעלות את לחץ השרוול של החיה anesthetised 160 מ"מ כספית, ובחיות ערה increASE לחץ השרוול 180 מ"מ כספית.
הערה: לחץ דם anesthetised של חולדות נע 120-140 מ"מ כספית ועולה ל 160 מ"מ כספית כאשר מודע. להתחיל הקלטות טיימר וטמפרטורת רגל פעם אחת הוא הגיע בלחץ הנכון.
הערה: טמפרטורת הרגל צריכה לרדת ב -2 מעלות צלזיוס לאחר 5 דקות של לחץ מתמיד. - לשמור על המיקום של השרוול מעל "הברך" של בעלי החיים ברחבי איסכמיה. לחץ השרוול יתחיל לרדת לאחר כמה דקות, או אם האיבר של החולדה נע.
- שוב ושוב לשאוב את הנורה האינפלציה בפרצים קצרים כדי לשמור על צרור קצר החוזר ונשנה לחץ שרוול הרצוי של שאיבה
- איסכמיה מרחוק יכולה להיות מועברת ברציפות בין 5 ל 15 דקות. פרוטוקול reperfusion איסכמיה כולל 2 תקופות של 5 דקות עם איסכמיה reperfusion 5 דקות חלף.
- להוציא את האוויר בלחץ השרוול על ידי שחרור שסתום לחץ האוויר. בדוק את שינוי הטמפרטורה במהלך פרו איסכמיהtocol. שחרר את השרוול.
- תמשיך עם ניסויים פציעה. בעלי חיים תחת השפעת ההרדמה יצטרכו להיות ממוקמים על משטח חום. תמשיך לעקוב אחר בעלי חיים עד אמבולטורי. לא ניתן להחזיר בעלי חיים לדיור עד הליכה.
6. אור פגיעה - רשתית ניוון דגם
- Dark להתאים את החיות הלילה (שעות 12-15). מייד לאחר איסכמיה אוויר מרוחק או איסכמיה דמה מרחוק (ריסון בעלי חיים) בעלי חיים במקום דיור פרספקס עם מזון ומים.
- לעבור על תאורת ניאון (1,000 לוקס) ממוקמת מעל דיור פרספקס שעה 9 בבוקר ל -24 שעות. בעקבות חשיפה לאור, להחזיר את בעלי החיים ללעמעם תאורה מחזורית למשך 7 ימים.
נהלי איסכמיה 7. לאחר מרחוק
- הערכת חזון עם electroretinogram (ERG):
הערה: הגדרת ERG ובזק פרוטוקול אחרי ברנדלי ואבן 26.- Dark להסתגל חיות לילה (12-15 שעות). תחתלעמעם תאורה אדומה להרדים בעלי החיים על ידי זריקת intraperitoneal של קטמין ו xylazine (60 מ"ג / קילוגרם ו 5 מ"ג / קילוגרם, בהתאמה). Mydriatic (סולפט אטרופין 1.0%), הרדמה קרנית (proxymetacaine 0.5%).
- החל לחות קרנית העין (פולימר קרבומר) יורדת באופן מיידי לקרנית. החל ג'ל עיניים ב 20 דקות במרווחים לשמור על הידרציה קרנית.
- לצייר חוט קשור ברפיון סביב גלגל העין כדי לסייע הקלטות ERG יציבים. צג טמפרטורה באמצעות בדיקה רקטלית ולשמור על טמפרטורת הגוף של בעלי החיים ב37-37.5 מעלות צלזיוס.
- מקם את הראש בתוך תחום שילוב Ganzfeld.
הערה: Ganzfeld הוא גירוי אור לתכנות מלא, המספק הבזקים כהוא אחידים מנוריות לעין. - רשום את electroretinogram באמצעות אלקטרודה מחוייט פלטינה 4 מ"מ חיובית נוגעת קלות הקרנית וקוטר 2 מ"מ אלקטרודה גלולה Ag / AgCl מוכנס לתוך הפה. התייחסות הן לאלקטרודות מחט נירוסטההוכנס מתחת לעור לתוך העכוז.
- שיא אותות עם הגדרת להקה עוברת מ0.3-1,000 הרץ (-3 dB), עם רכישה בשיעור 2 קילוהרץ (מכשירים לספירה). לאחר הקלטת ERG יציבה הוקמה נושא בעלי החיים להסתגלות כהה 10 דקות לפני תחילת הקלטות.
- בצע את פרוטוקול הבזק כפי שתואר בעבר על ידי ברנדלי ואבן 26.
- לתכנת את משך הבזק (השתמשנו הבזקים 1-2 אלפית שני בזמן), ולהגדיר את עוצמתו ל-4.4 ל -2.0 יומן סקוטי cd.sm -2. השתמש הבזקים בהירים (cd.sm 2.0 יומן הסקוטי -2, 1 ms) כדי למדוד את תפקוד הרשתית. במחקר זה היא ההשוואה בין שליטה, פציעה קלה ופציעה קלה עם RIP.
8. TUNEL Assay
- להרדים בעלי חיים על ידי זריקת intraperitoneal של מנת יתר phenobarbital (100 מ"ג / קילוגרם). Enucleate העיניים ולתקן paraformaldehyde 4%.
- לשטוף את העיניים בPBS לפני cyroprotectingעיני הלילה ב -30% סוכרוז (w / v). להטביע את העיניים במתחם OCT וחתוך למקטעים של 20 מיקרומטר sagittal באמצעות cryostat.
- בצע את assay TUNEL על סעיפי רשתית עם מכתים DAPI הבא הפרוטוקול של et al Maslim. 27
- השתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי לספירת TUNEL של הרשתית. תאי TUNEL נרשמו מהשכבה החיצונית הגרעינית (ONL); השכבה החיצונית ביותר של הרשתית המכילה גרעיני קולטי האור. במחקר זה, ספירת TUNEL נעשתה בשלושה עותקים לכל עין, עם 5 עיניים לכל קבוצת טיפול.
- השתמשו בכיוון אחד ANOVA לקבוצה סטטיסטית להשוות אמצעי שליטה, פציעה קלה, וחולדות פציעה + RIP אור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שרוול לחץ דם גבוה למעל 160 מ"מ כספית עוצר את זרימת דם לגפיים האחורי כפי שניתן לראות בבירור באיור 1. חוסר חמצון רקמות הביא הפחתת טמפרטורת הרגל של בעל החיים לפרוטוקול איסכמיה reperfusion (איור 2). טמפרטורת הרגל (33 מעלות צלזיוס) הייתה נמוכה מטמפרטורת ליבה ומופחתת באופן מהימן בגובה שרוול לחץ (31 מעלות צלזיוס) עולה כאשר השרוול היה מנוכה (32 מעלות צלזיוס). אחת פציעת אור 1,000 סוויטה דה לוקס נמסרה לעמעם העלתה חולדות לבקן עם או בלי נפשית מראש איסכמי מרחוק. תפקוד רשתית נרשם והוערך באמצעות electroretinogram (ERG).
ERG הוא הסיכום של תגובות חשמליות שמקורו בתאי העצב הפנימי וחיצוניים של הרשתית לגירוי אור, כפי שמוצג באיור 3. יש גל ERG שיא שלילי מוקדם נובע מphototransduction (מינימום כ 10 אלפיות שני לאחר ניהול תאורההבזק t) כינה את הגל ושיא חיובי גדול מהפנימי הרשתית (המקסימום כ 80 אלפיות שניים לאחר הבזק אור) כינה ב-הגל. ERG הכהה מותאם מעמום נורמלית העלה עכברוש הראה קולטי האור גדולים ותגובת רשתית פנימית לcd.sm -2 הבזק בהיר 2.0 יומן (איור 3 א). שבוע בעקבות פציעה קלה היו הקלטות ERG הפחתה חמורה במשרעת ביחס לקבוצת ביקורת, המשקפת את האובדן של קולטני האור; ראה איור 3 ב. נפשית מראש גפיים האחוריות עם איסכמיה באמצעות פרוטוקול reperfusion של 2 x 5 דקות מייד לפני איסכמיה מוגנת קולטני האור מפציעה קלה. אמפליטודות RIP ERG היתה גדולה יותר מפגיעת אור לבד, עם ירידה קלה לכס-הגל (איור 3 ג). תיוג סוף dUTP ניק transferase deoxynucleotidyl מסוף assay (TUNEL) על סעיפי cryopreserved של הרשתית אישר הפחתה של תאים אפופטוטיים בבעלי חיים שנפגעו אור קבלת rel RIPבעלי חיים פגיעת אור יצירתי דמה שטופלו (איור 4).
האינדוקציה של איסכמיה לגפיים האחוריות מסתמכת על המיקום הנכון של השרוול, כפי שניתן לראות באיור 1. שרוול ממוקם מתחת ל" הברך "אינו מגן על קולטני האור מפציעה קלה כפי שהיא משתקפת באמפליטודות ERG המופחתת, ראה איור 3D.
לסיכום, כאשר מנוהלים בצורה נכונה איסכמיה איבר האחורית הייתה מסוגלת להגן על תאי עצב ברשתית מפציעה קלה.
איור 1:. מיקום חפת והשפעה של לחץ שרוול מעל 160 מ"מ כספית (א) מציג את הגפיים אחוריות ורגל לפני העלאת לחץ שרוול. (ב) מציג את הרגל במהלך של העלאת לחץ שרוול מעל 160 מ"מ כספית. שים לב למיקום של השרוול מעל "k לבית ". לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. טמפרטורת רגל מצטמצמת באינפלצית שרוול אינפלציה של השרוול בגפיים האחורי עבור 2 x 5 דקות ב160 מ"מ כספית מופחתים טמפרטורת עור במהלך איסכמיה. (א) מציג את ממוצע קבוצה לשינויי טמפרטורת רגל RIP 2 x 5 דקות. (ב) מראה טמפרטורת נציג רגל (° C) התחקות עבור 2 x 5 דקות איסכמיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
00 "/>
איור 3:. RIP שומר תפקוד רשתית כפי שהודגם בהשוואה לחולדות ERG נזק אור חשיפה לאור בהיר במשך 24 שעות נזקי קולטני האור ברשתית. ERG מודד את הבריאות של רשתית פנימית וחיצונית כתגובה חשמלית (מיקרוולטים [μV]) לגירוי אור. התגובה הנורמלית ברשתית לcd.sm 2.0 יומן -2 גירוי האור ראה ב(). נזק קולטי האור מתוצאות אור בהירים במשרעת קטנה יותר ERG (B). RIP היה מסוגל להציל את קולטני האור בעקבות פציעה קלה (C). מיקום שרוול שגוי במהלך RIP אינו מגן על קולטני האור מפציעה (ד '). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
"Width =" 600 4highres.jpg "/>
ספירת TUNEL + תא: איור 4. גרף עמודות השוואת תוצאת קבוצה לפציעה קלה, פציעה + RIP להדגים את הירידה באפופטוזיס עם RIP. TUNEL + תא נספרו על פני כל הטווח של הרשתית (8000 מיקרומטר). פנל עליון: ממוצע קבוצת TUNEL + התאים היו נמוך יותר עבור חולדות שטופל RIP (210 ± 4.9, n = 5) בהשוואה לפציעה קלה בלבד (255 ± 10, n = 5), p <0.01, בכיוון אחד ANOVA. רשתית ניזוק (לא פציעה קלה) הייתה נמוכה מאוד (3.0 ± 1.4, n = 5) תאים אפופטוטיים. תמונת נציג (א) של רשתית נפצעה אור מעולה. תמונה מייצגת של רשתית RIP-אור מעולה נפצעה (B). תמונה מייצגת של רשתית אור נפצע נחות (C). תמונה מייצגת של רשתית RIP-אור נחותה נפצעה (ד '). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זהדמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
איסכמיה גפיים אחוריות מכרסמים הייתה מושרה בהצלחה עם מד לחץ דם ידני ולאזוק את אספקת neuroprotection לקולטני האור ברשתית. ממצא עקבי עם הגנת אוויר מושרה איסכמי של קולטני האור מפגיעת אור 9,28.
בעיקרו של דבר, איסכמיה מרחוק גורמת מחסור בחמצן לרקמות קצר. לפיכך, יש נפשית מראש איסכמי מרוחק דמיון רב לאוויר איסכמי או סובלנות איסכמי מכונה לחלופין, נפשית מראש חוסר חמצן, ובמידה מסוימת, פעילות אנאירובית. תאים מגיבים לאתגר איסכמי על ידי שחרור מגוון גדול של גורמי חלבונים, נוקלאוזידים ושעתוק שגם מציעים neuroprotection ישירות או משפיעים על תאים להפוך סובלני של מתח חילוף חומרים הבא 13.
בספרות, פרוטוקולי איסכמיה מרוחקים כללו מגוון של המשכים ותדרים. המעבדה שלנו בדקה 5, 10,ו -2 x 5 פרוטוקולי איסכמיה דקות על תפקוד רשתית רגיל 26. פרוטוקולים אלה 2 x 5 דקות מיוצרות השינוי משרעת ERG הגדול ביותר בחולדות נורמליות ונבחרה לבדיקה במודל של פציעה קלה. אירועים איסכמיים 5 דקות קצרות וחזרו גם הוכחו להיות מונעים בשבץ חוזר בבני אדם וכדי להקטין את גודל אוטם בשבץ ניסיוני בחזירים 17,22. עם זאת, המשך המתאים ביותר של נפשית מראש איסכמי עשוי להיות תלוי במודל החיה בשימוש. לדוגמא, ירידה בגודל אוטם נגד איסכמיה מוקדי נצפתה בדקות ארוכות 2 x 15 x 15 ו -3 פרוטוקולי דקות, אבל לא ב3 x 5 דקות פרוטוקולים בחולדות 15.
הזמן בין IP ופגיעת איסכמית גם צריך להיחשב לneuroprotection היעיל. שני חלונות זמן סווגו להגנה לבבית הנגרמת על ידי ה- IP. אלה הם החלון "אוויר הקלאסי", אשר מתרחש 0-12 שעות לאחר IP ו"החלון השני", שבו מתרחש 3-4 ימים לאחר IP 29. במודל שבץ מוקדי, RIP נמצא מגן בנקודות זמן מרובים, כוללים אלה שמחוץ לחלונות הקלאסיים והשני 15. עם זאת, יש כבר כמה מחקרים שהשוו את פרקי הזמן של neuroprotection בRIP ו- IP.
שיקול נוסף להגנת איסכמיה מרחוק הוא העיתוי של אוויר, לרבות אם הוא מוחל לפני פציעה (נפשית מראש) או לאחר פציעה (postconditioning). רוב בדיקות איסכמיה מרוחקות השתמש נפשית מראש למרות postconditioning לאחרונה מחקרים שנמצאו כמגן של שני נוירונים ברשתית ומוח 30,31.
לסיכום, האינדוקציה של neuroprotection באוויר איסכמי גפיים האחורי היא ספציפית למודל המחלה, המינים של בעלי חיים, את משך הזמן של איסכמיה, והעיתוי של איסכמיה. סקירה על ידי אל Kaniora et. עמ 'rovides פרטים נוספים על מגוון רחב של פרוטוקולים מרוחקים איסכמיה, כוללים המינים, פרוטוקולי RIP, RIP אתרים, מודלים פציעה, תוצאות פציעה ומנגנוני הגנה שהוצעו 32.
השרוול פולשנית בגפיים האחורי מאפשר לRIP בשתי ערים ובעלי חיים הניתנים נשמר בטמפרטורת הגוף. בניסויים בהרדמה, טמפרטורת הגוף של בעל החיים חייב להישמר כדי למנוע היפותרמיה. ניטור טמפרטורה פנימי ימנע בעלי החיים עוברים היפותרמיה או היפרתרמיה. היפותרמיה והיפרתרמיה הן גירויים מראש אוויר ידוע בשני דגמי שבץ ופגיעת אור 33-36. שיטת יופיטר הציגה יכולה להתבצע בבעלי חיים ער ובכך למנוע בלבול טמפרטורת גוף.
הרדמה עשויה להציג את קבוצה של בלבול בניסויים RIP שונה. Isoflurane יכולה להשתתף בהגנת שריר הלב באמצעות פתיחה של פרק אשלגן ATP רגישannels, מנגנון הגנה דומה דווח באוויר איסכמי 37. למרות הגודל של האוטם בדגמי שבץ נותר גדול בבעלי החיים שטופל בדמה נתון isoflurane, אוויר איסכמי המרוחק הבסיסי המנגנון המולקולרי עשוי להיות רעול פנים על ידי ההשפעות של הרדמה. קטמין, אנטגוניסט NMDA, יש שפע של השפעות מגנות in vivo 38, כוללים הפוטנציאל למניעת הפעלת יתר רעילה לתאי עצב, להפעיל את מסלול mTOR ולשחרר BDNF לסרום 39-41. קטמין דווח כדי לשפר את ההישרדות עצבית בעקבות טראומת מוח בבני אדם ולהפחית פגיעת אור בקולטני אור מכרסמים 42,43. חקירות לתוך המנגנון של אוויר איסכמי מרחוק עם איזוק לחץ דם ער תהיה למנוע בלבול הרדמה.
איסכמיה גפיים אחוריות היעילה מסתמכת על המיקום הנכון של השרוול, עקביות של לחץ השרוול והעלאת לחץ שרוול מעל systoלחץ Lic דם כפי שניתן לראות באיור 1. שרוול ממוקם מתחת ל" הברך "אינו מגן על קולטני האור מפציעה קלה כפי שהיא משתקפת באמפליטודות electroretinogram מופחת (ERG). ההבדל באוויר המבוסס על העמדה של השרוול הוא כנראה עקב הבדלים במסת שריר וקרבה לעורק הירך. בנוסף, בעלי חיים צריכים להיות אחידים לגיל, משקל, טמפרטורת גוף ומגדר.
לסיכום, איסכמיה מרחוק יכולה להיגרם על ידי שרוול לחץ דם לא פולשנית, אשר ימנע פגיעה בשרירים ויש לו את הגמישות לניסויים ער או בהרדמה. נפשית מראש איסכמי מרחוק הוא אסטרטגית neuroprotective מתעורר ופרוטוקול זה יאפשר מחקרים נוספים למנגנונים והיישומים שלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold series DuraShock hand aneroid sphygmomanometer | Welch Allyn | DS56 | Manual Sphygmomanometer |
| Neonate [size 2] 1 tube, 10 pack | Welch Allyn | 5082-102-1 | Limb blood pressure cuff |
| Luer lock adaptor | Welch Allyn | 5082-178 | Adaptor for neonatal cuff |
| Thermistor pod | AD Instruments | ML 309 | skin tempertature unit |
| Skin temperture probe | AD Instruments | MLT 422/A | |
| Powerlab, 4 channel acquistion hardware | AD Instruments | PL 35044 | |
| Homeothermic blanket system with flexible probe | Harvard Appartus | 507222F | |
| Towel | optional: awake remote ischemia | ||
| Isoflo - 100% Isoflurane (250 ml) | Abbot Animal Health | 05260-05 | optional: inhaltion anaesthetic remote ischemia |
| Ketamil - ketamine 100 mg/ml (50 ml) | Troy Laboratories Pty Ltd | optional: injectable anaesthetic remote ischemia | |
| Xylium - Xylazine 100 mg/ml (50 ml) | Troy Laboratories Pty Ltd | optional: injectable anaesthetic remote ischemia |
References
- Meller, R., Simon, R. P. Tolerance to Ischemia-an Increasingly Complex Biology. Translational Stroke Research. 4 (1), 40-50 (2013).
- Sun, J., et al. Protective effect of delayed remote limb ischemic postconditioning: role of mitochondrial K-ATP channels in a rat model of focal cerebral ischemic reperfusion injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (5), 851-859 (2012).
- Harkin, D. W., D'Sa, A., McCallion, K., Hoper, M., Campbell, F. C. Ischemic preconditioning before lower limb ischemia-reperfusion protects against acute lung injury. Journal of Vascular Surgery. 35 (6), 1264-1273 (2002).
- Murry, C. E., Jennings, R. B., Reimer, K. A. Preconditioning with ischemia -A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation. 74 (5), 1124-1136 (1986).
- Barone, F. C., et al. Ischemic preconditioning and brain tolerance - Temporal histological and functional outcomes, protein synthesis requirement, and interleukin-1 receptor antagonist and early gene expression. Stroke. 29 (9), 1937-1950 (1998).
- Roth, S., et al. Preconditioning provides complete protection against retinal ischemic injury in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (5), 777-785 (1998).
- Wegener, S., et al. Transient ischemic attacks before ischemic stroke: Preconditioning the human brain? A multicenter magnetic resonance imaging study. Stroke. 35 (3), 616-621 (2004).
- Weih, M., et al. Attenuated stroke severity after prodromal TIA - A role for ischemic tolerance in the brain. Stroke. 30 (9), 1851-1854 (1999).
- Casson, R. J., Wood, J. P. M., Melena, J., Chidlow, G., Osborne, N. N. The effect of ischemic preconditioning on light-induced photoreceptor injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (3), 1348-1354 (2003).
- Ettaiche, M., et al. ATP-sensitive potassium channels (K-ATP) in retina: a key role for delayed ischemic tolerance. Brain Research. 890 (1), 118-129 (2001).
- Gross, E. R., Gross, G. J. Ligand triggers of classical preconditioning and postconditioning. Cardiovascular Research. 70 (2), 212-221 (2006).
- Heurteaux, C., Lauritzen, I., Widmann, C., Lazdunski, M. Essential role of adenosine, adenosine-A1-receptors, and ATP-senstive K+ channels in cerebral ischemic preconditioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (10), 4666-4670 (1995).
- Dirnagl, U., Simon, R. P., Hallenbeck, J. M. Ischemic tolerance and endogenous neuroprotection. Trends in Neurosciences. 26 (5), 248-254 (2003).
- Ren, C., et al. Remote ischemic post-conditioning reduced brain damage in experimental ischemia/reperfusion injury. Neurol Res. 33 (5), 514-519 (2011).
- Ren, C., Gao, X., Steinberg, G. K., Zhao, H. Limb remote-preconditioning protects against focal ischemia in rats and contradicts the dogma of therapeutic time windows for preconditioning. Neuroscience. 151 (4), 1099-1103 (2008).
- Hu, S., et al. Noninvasive limb remote ischemic preconditioning contributes neuroprotective effects via activation of adenosine A1 receptor and redox status after transient focal cerebral ischemia in rats. Brain Research. 1459, 81-90 (2012).
- Jensen, H. A., et al. Remote Ischemic Preconditioning Protects the Brain Against Injury After Hypothermic Circulatory Arrest. Circulation. 123 (7), 714-721 (2011).
- Kuntscher, M. V., et al. Ischemic preconditioning by brief extremity ischemia before flap ischemia in a rat model. Plastic and Reconstructive Surgery. 109 (7), 2398-2404 (2002).
- Kharbanda, R. K., et al. Transient limb ischemia induces remote ischemic preconditioning in vivo. Circulation. 106 (23), 2881-2883 (2002).
- Perl, W., Cucinell, S. A. LOCAL BLOOD FLOW IN HUMAN LEG MUSCLE MEASURED BY A TRANSIENT RESPONSE THERMOELECTRIC METHOD. Biophysical Journal. 5 (2), 211-230 (1965).
- Vuksanovic, V., Sheppard, L. W., Stefanovska, A. Nonlinear relationship between level of blood flow and skin temperature for different dynamics of temperature change. Biophysical Journal. 94 (10), L78-L80 (2008).
- Meng, R., et al. Upper limb ischemic preconditioning prevents recurrent stroke in intracranial arterial stenosis. Neurology. 79 (18), 1853-1861 (2012).
- Souza, M. V. P., et al. Hind limb ischemic preconditioning induces an anti-inflammatory response by remote organs in rats. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 42 (10), 921-929 (2009).
- Hixson, F. P., Shafiroff, B. B., Werner, F. W., Palmer, A. K. DIGITAL TOURNIQUETS - A PRESSURE STUDY WITH CLINICAL RELEVANCE. Journal of Hand Surgery-American. 11A (6), 865-868 (1986).
- Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. Evans Blue Dye as an in vivo marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. Journal of Anatomy. 200 (1), 69-79 (2002).
- Brandli, A., Stone, J. Remote ischemia influences the responsiveness of the retina: observations in the rat. Invest Ophthal Vis Sci. 55 (4), (2014).
- Maslim, J., Valter, K., Egensperger, R., Hollander, H., Stone, J. Tissue oxygen during a critical developmental period controls the death and survival of photoreceptors. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 38 (9), 1667-1677 (1997).
- Grimm, C., et al. HIF-1-induced erythropoietin in the hypoxic retina protects against light-induced retinal degeneration. Nature Medicine. 8 (7), 718-724 (2002).
- Vander Heide, R. Clinically Useful Cardioprotection: Ischemic Preconditioning Then and Now. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 251-254 (2011).
- Zhou, Y. L., et al. Remote Limb Ischemic Postconditioning Protects Against Neonatal Hypoxic-Ischemic Brain Injury in Rat Pups by the Opioid Receptor/Akt Pathway. Stroke. 42 (2), 439-444 (2011).
- Hasegawa, J., Obara, T., Tanaka, K., Tachibana, M. High-density presynaptic transporters are required for glutamate removal from the first visual synapse. Neuron. 50 (1), 63-74 (2006).
- Kanoria, S., Jalan, R., Seifalian, A. M., Williams, R., Davidson, B. R. Protocols and mechanisms for remote ischemic preconditioning: A novel method for reducing ischemia reperfusion injury. Transplantation. 84 (4), 445-458 (2007).
- Maier, C. M., et al. Optimal depth and duration of mild hypothermia in a focal model of transient cerebral ischemia - Effects on neurologic outcome, infarct size, apoptosis, and inflammation. Stroke. 29 (10), 2171-2180 (1998).
- Reith, J., et al. Body temperature in acute stroke: Relation to stroke severity, infarct size, mortality, and outcome. Lancet. 347 (8999), 422-425 (1996).
- Barbe, M. F., Tytell, M., Gower, D. J., Welch, W. J. HYPERTHERMIA PROTECTS AGAINST LIGHT DAMAGE IN THE RAT RETINA. Science. 241 (4874), 1817-1820 (1988).
- Wang, X. D., et al. Neuronal degradation in mouse retina after a transient ischemia and protective effect of hypothermia. Neurological Research. 24 (7), 730-735 (2002).
- Tonkovic-Capin, M., et al. Delayed cardioprotection by isoflurane: role of K(ATP) channels. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 283 (1), H61-H68 (2002).
- Pfenninger, E., Himmelseher, S. Neuroprotective effects of ketamine on a cellular level. Anaesthesist. 46, S47-S54 (1997).
- Hirose, K., Chan, P. H. BLOCKADE OF GLUTAMATE EXCITOTOXICITY AND ITS CLINICAL-APPLICATIONS. Neurochemical Research. 18 (4), 479-483 (1993).
- Welberg, L. Psychiatric disorders: Ketamine modifies mood through mTOR. Nature reviews. Neuroscience. 11 (10), 666 (2010).
- Garcia, L. S. B., et al. Acute administration of ketamine induces antidepressant-like effects in the forced swimming test and increases BDNF levels in the rat hippocampus. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 32 (1), 140-144 (2008).
- Wassle, H.
- Hertle, D. N., et al. Effect of analgesics and sedatives on the occurrence of spreading depolarizations accompanying acute brain injury. Brain. 135, 2390-2398 (2012).
