우리는 근섬유아세포 표현형을 가진 쥐와 인간 식도 기질 세포의 1차 배양을 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 배양된 세포는 방추체 모양의 형태를 가지고 있으며 α-SMA 및 비멘틴을 발현하며 상피, 조혈 및 내피 세포 표면 마커가 없습니다. 특성화된 기질 세포는 상피-기질 상호 작용의 기능적 연구에 사용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
설치류와 인간의 식도 근육 섬유 모세포는 소화 효소를 통해 생성된다. 신생아 (8~12일 세) 쥐의 식도, 수확 다진, 세척하고, 25 분 동안 콜라게나 제와 디스 파제와 소화 효소 실시한다. 인간 식도 절제 표본 근층 고유 층과 외막의 벗겨, 나머지의 점막 다진되고, 최대 6 시간 동안 콜라게나 제와 디스 파제 및 소화 효소를 실시. 배양 된 세포는 α-SMA 및 멘틴 및 명시 최근 desmin 약하게 또는 전혀 표현한다. 배양 조건은 상피 세포, 조혈, 또는 내피 세포의 성장에 도움이되지 않습니다. 문화 순도는 또한 잠재적 오염 조혈 및 내피 세포의 세포 표면 마커의 발현을 유세포 평가에 의해 확인된다. 설명 된 기술은 간단하며 비 hematopoieitc 비 내피 간질 세포의 일관된 발생을 초래한다. 이 기술의 한계의 사용에 내재즉, 분자 생물학 연구의 주요 문화, 피할 수없는 변화는 다른 쥐 또는 인간 전반에 걸쳐 문화 사이에 발생했습니다. 그러나 차 배양 세포주에 비해 생체 상태의 대표성 반사된다. 이러한 방법은 연구자들에게 집단 간의 비교를 가능하게 분리 할 수있는 능력과 다른 임상 및 실험 조건에서 배양 기질 세포를 제공한다. 특성화 식도 기질 세포는 식도 상피의 질환 - 간질 상호 작용을 조사하는 연구에 사용될 수있다.
서론
상피 기질 상호 작용 재생 점막, 보수, 섬유증 및 발암 1,2- 포함한 위장관 다양한 기능의 조절에 관여한다. 이러한 상호 작용은 가장 작은 창자 및 결장에서 연구되었다 마찬가지로 식도 점막 질환 3에서 역할을 수행 할 수있다. 장과 대장 기질 세포라고 근육 섬유 모세포의 하위 집단은 조직 손상, 염증을 중재에 참여하고 4,5를 복구하는 입증되었다. 원위 위장관에서 이러한 스핀들 모양의 세포는 상피와 고유 층 사이의 계면에서 기저막에 인접하고, α-SMA 및 멘틴으로 정의 된 양,-팬 아세포 부정하고, 약한 양성 또는 최근 desmin 5 음.
식도 기질은 엄격하게 세포 또는 분자 수준에서 특징되지 않았습니다. 쥐의 식도에있는 우리의 작업은 취소했다monstrated의 α-SMA 편평 상피 6 때때로 밑의 식도 기질과 멘틴 세포. 상피 세포 - 기질 상호 작용 등의 위식도 중재 부상 (6)과 호산 구성 식도염 3과 식도 점막 질환에 연루되어있다. 섬유 성 협착은 위장 섬유증의 발병에 연루되어 식도 부상과 간질 세포의 알려진 합병증이다. 이러한 세포의 분리 미친 신호 전달 경로를 조사하는 데 필요한 연구....
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프로토콜
프로토콜은 동물 실험, 이론적 근거와 연구의 목적을 수행하기 위해, 남부 캘리포니아 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 제출하여 승인을했다.
취소 확인 된 인간의 식도 표본에서 차 문화의 설립을위한 프로토콜은 남부 캘리포니아 심사위원회 (Institutional Review Board)의 대학에 의해 승인되었다.
1. 마우스 또는 인간의 식도를 얻습니다
- 마우스 식도를 얻습니다
- 자궁 경부 전위 다음에 2 % 이소 플루 란 흡입 과다 복용으로 8-12 일 이전 마우스를 안락사.
- 아래로 향 배와 동물을 핀 및 70 % 에탄올로 복부 표면을 젖은. 핀셋으로 잡고 집게로 요도에 피부 앞쪽을 들어 올립니다. 턱 요도에서 복부 정중선을 따라 잘라 표준 바로 수술 가위를 사용합니다. 만 피부를 잘라주의하십시오.
- "Y"거꾸로 형성 동물 양쪽 무릎 하방 개구부로부터 요도 절개를. 흉곽 따라 동물의 양쪽에 다른 절개를합니다.
- 조심스럽게 기본 복막과 흉곽의 떨어져, 양쪽의 피부를 벗겨과 측면에 누워. 흉강과 복강을 덮는 복막 위에 놓인 흉곽을 검사합니다.
- 복부 내용....
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결과
기계 및 소화 효소를 사용하여 격리 식도 기질 세포는 처음 도금 6 웰 플레이트에서 배양된다. 도금 시간 내에 거꾸로 현미경으로 세포의 시험은 판 바닥 (그림 1A)에 느슨하게 부착 혼합 세포 현탁액을 보여줍니다. 다음 24 시간에 걸쳐, 접시 바닥에 견고하게 부착 방추형 세포가 혼합 된 세포 현탁액 돋 셀 웰 오일 내에서의 전체 영역을 커버 및 형태 유지, 성공적으로 계대 수 .These (도 1b)에서 촬영 관찰 적어도 15 구절. 스핀들 모양의 접착 세포는 저밀도 (그림 1C) 때 거의 합류 (그림 1D)에서 관찰된다.
챔버 슬라이드에서 재배 식도 기질 세포의 차 문화의 면역 염색 (그림 α-SMA 및 멘틴 근섬유 아세포의 세포 골격 마커의 풍부한 표정을 보여줍니다우레 2), 최근 desmin의 약한 표현하고, 결석 아세.......
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토론
조직의 크기에 적합한 닦지 소화 회 뮤린 또는 인체 조직을 사용할 때 차 배양 생성 기법은 일반적으로 유사하다. 뮤린 조직의 경험은 상술 한 방법을 사용하는 것이 일관되게 차 배양의 성공 확립 될 것을 제안한다. 프로토콜 내에서 중요한 단계는 수술 장비의 살균 및 조직 문화의 표준 멸균 기술을 다음과 같습니다. 마우스의 나이는 중요한 단계입니다. 8~12일 된 신생아는 지속적으로 성공 차 문화를 얻을 수 있습니다. 이하 신생아로부터 단리 간질 세포가 성공적으로 생성되지되지 않았다. 이전 마우스에서 근섬유와 같은 기질 세포를 확립하려는 시도는 계속되고. 다른 사람들은 4 ~ 8 주 된 쥐 8 일부터 식도 섬유 아세포의 성공적인 세대를 신고되었습니다.
대장 근육 섬유 모세포의 설립과는 달리, 오염 전자에서 자주 문제입니다쥐의 근육 섬유 모세포의 문화 stablishment 항생제는 배양 배지에 포함되는 경우. 문화가 신생아 쥐에서 설립되어 있기 때문에, 제한 .......
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공개 사항
이 작품은 굿 생리학과 건강 (AS)와 라이트 재단 파일럿 상 (AS)에 NIH / NCI K08CA153036-01A1 (AS), 건강의 AGA-제너럴 밀스 벨 연구소 및 영양 연구 학술 상에 의해 지원됩니다.
감사의 글
저자는 공개 할 것이 없습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 조직 배양 시약 | |||
| HBSS | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Dispase | GIBCO, Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| DMEM | GIBCO, Invitrogen | 11965-092 | |
| 소르비톨 | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F42442 | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202-001 | |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl | |
| 표피 성장 인자 | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| 면역 염색용 시약 | |||
| 염소 혈청 | Sigma Aldrich | G9023 | |
| 마우스 mAB to α-SMA | abcam | ab7817 | |
| Rabbit pAB to vimentin | abcam | ab45939 | |
| Cy2 conjugated Goat anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-225-144 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | |
| CD31 conjugated to eFluor 450 | eBioscience | 48-0319-41 | |
| CD90 conjugated to APC | eBioscience | 17-0909-41 | |
| Annexin V 및 7AAD | BD Pharmigen 559763 | ||
| 마우스 Fc 블록 for CD16/CD32 | BD Pharmigen | 2136662 | |
| 장비 | |||
| 5ml 튜브 | Eppendorf | 30108310 | |
| 도립 현미경 | Motic | AE31 | |
| 생물 안전 캐비닛 및 인큐베이터 | Nuaire | http://www.nuaire.com/products/ | |
| 4웰 챔버 슬라이드 | Thermo Scientific | 177437 | |
| 냉장 원심분리기 | Eppendorf | 5810R | |
| Olympus 진공 구동 필터 시스템 | Genesee Scientific | 25-227 | |
| 형광 현미경 | Nikon | Eclipse TE300 | |
| 6웰 플레이트 | Corning | 3516 | |
| T25 플라스크 | TRP | 90026 | |
| T75 플라스크 | Corning | 43064 | |
| 해부 가위 | |||
| 게 | |||
| 단일 팁 Q-팁 | Kendall | 540500 | |
| 소프트웨어 | |||
| Metamorph 소프트웨어 (분자 장치) | 분자 장치 | ||
| FACSCAlibur | BD Bioscience | ||
| FACSVerse | BD Bioscience |
참고문헌
- Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair. Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria. Annu Rev Physiol.
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재인쇄 및 허가
