Method Article

개발 체외 모델 시스템 에쿠스 caballus의 IgE

DOI:

10.3791/52222

⸱

November 1st, 2014

 ,  , 
1Biological Department, King Abdulaziz University, 2The Krebs Institute for Biomolecular Research, Department of Molecular Biology and Biotechnology, The University of Sheffield

In This Article

Summary

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현재 연구는 쥐 호염우기 백혈병 세포와 말 FcεRIα 유전자의 형질주입을 기반으로 하는 유전자 조작 분석 시스템의 개발 및 응용을 설명합니다. 형질주입된 세포는 IgE와 항원에 의해 알레르기 반응의 매개체 방출이 활성화될 수 있는 기능적 수용체를 발현합니다.

Abstract

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IgE와 친화성이 높은 Fc 수용체(FcεRI)의 상호 작용 후 항원 챌린지가 IgE 매개 알레르기 반응의 주요 경로입니다. IgE와 FcεRI 사이의 높은 친화도 결합과 B 세포에 의한 IgE의 지속적인 생산으로 인해 알레르기는 일반적으로 평생 동안 지속되며 현재로서는 영구적인 치료법이 없습니다. 말, 특히 일반적으로 근친 교배되는 경주마는 과민 반응이 발생하기 매우 쉬운 포유류 종으로, 성능에 심각한 영향을 미칠 수 있습니다. 말의 알레르기 감작에 대한 생리학적 반응은 인간과 개에서 관찰된 것과 유사합니다. 이 논문에서는 말 시스템과 관련된 알레르기 반응의 매개체 방출에 대한 정량적 평가를 위한 현장 분석 시스템의 개발에 대해 설명합니다. 이를 위해 말 FcεRIα를 암호화하는 유전자를 부모 쥐 Basophil Leukemia(RBL-2H3.1) 세포로 형질주입하여 발현시켰습니다. 형질주입된 말 α사슬의 유전자 산물은 내인성 쥐 β사슬 및 γ사슬과 함께 기능적 수용체 복합체를 형성했습니다 1. 그 결과 얻은 분석 시스템은 β-hexosaminidase 방출을 판독값으로 사용하여 말 IgE 및 항원 챌린지에 대한 감작 후 말 FcεRIα transfection된 RBL-2H3.1 세포에서 분비되는 매개체의 양을 평가하는 데 도움이 되었습니다 2, 3. 매개체 방출은 항원 100ng ml-1에서 36.68%± 4.88%로 최고조에 달했습니다. 이 분석법은 인간과 개의 알레르기 반응을 연구하는 데 사용된 이전 분석법에서 수정되었습니다 4, 5. 우리는 또한 이러한 유형의 분석 시스템이 알레르기 질환에 대한 진단 도구 개발 및 잠재적 치료 중재 전략의 안전성 평가에 여러 가지 응용 프로그램이 있음을 보여주었습니다 6, 2, 3.

Introduction

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알레르기는 천년 알려져있다. 천식 치료는 Ebers 파피루스 (~ 1550 BCE)로 알려진 고대 이집트 의료 텍스트에 설명하고 7을 치료하는 한약을 논의했다.

현재 알레르기는 T 헬퍼 세포 유형 2 (TH (2)) 면역계의 아암 알레르겐이라고 환경 항원에 반응하여 면역 글로불린 E (IgE의) 항체의 생산을 조향 타입 I의 과민 반응으로 분류된다. 이들은 일반적으로 면역계 세포와 상호 작용 된 IgE 합성을 담배 연기 또는 디젤 배기 미립자 입자 향상 않은로서 인터루킨 -4 및 인터루킨 13 (8, 9)을 포함하여 합성 및 염증성 사이토 카인의 분비를 자극하는 다양한 물질이다 10.

지난 50 년 동안 선진국에서 알레르기 증상의 상승의 효과의 조합에 기인 된'위생 가설'(11)에 의해 제안 된 TH 사이토 카인이 지배적 프로파일 향해 면역 반응을 전환하기 위해 결합 환경 오염 물질 및보다 위생적 환경 동향.

전술 한 바와 같이, 인간 알레르기 시달리다 만 포유류 아니다. 특히 말과 개는 클래식 알레르기 반....

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Protocol

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세포주의 1) 준비 :

  1. 말 FcεRI α의 발현 RBL-2H3.1 세포주 개발 :
    1. 28 : 단층 세포 라인에 대한 기본 조직 배양 기술을 이용하여 말 FcεRIα 유전자 (GenBank 등록 Y18204.1)를 들고, pEE6 플라스미드를 사용하는 부모 RBL-2H3.1 세포를 형질. 1.2 X10 7 셀 ML -1의 밀도로 세포의 0.8 ml의 플라스미드 DNA의 2 μg의 μL -1을 추가합니다. 즉시 10 분 동안 얼음에서 인큐베이션 0.4 cm의 electrocuvette를 이용한 250 V 960 μF에서 세포 Electroporate.
    2. 네티의 G418 황산 0.4 g을 포함하는 미디어를 사용하여 형질 전환 된 세포를 선택한 다음, 형광 면역 글로불린 항체로 태그를 지정하여 FACS를 통해 남아있는 살아있는 세포를 정렬 할 수 있습니다. 수사 2, 3에 대해 말 FcεRIα 세포주를 발현 RBL-얻어진 2H3.1 사용.
  2. 사전 분석 항체 감작 :
    1. 5 셀 ML의 -1의 세포 밀도로 배양 배지에 세포를 다시 중단....

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Results

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부모 RBL-2H3.1 세포 및 말 FcεRIα 수용체 유전자로 형질들은 먼저 마우스의 IgE 항 DNP-HSA 감작과 DNP-HSA 항원으로 감염시켰다. 마우스 IgE의 양쪽 세포주에서 내인성 쥐 수용체에 결합하므로 매개체 (그림 1 A)를 풀어 두 세포주의 분리 가능성을 테스트하기 위해 대조군으로서 작용한다. 이 중요한 검사이며, 세포 배양에 확장 (> 10 주) 통과에 정기적으로 이후 수행되어야한다, RBL-2H3.1 세포는 비 분비 표현형 (27)을 향해 표류. 말 FcεRIα 수용체를 발현하는 세포가 5.76 % ± 45.99 %의 최대 중재자 릴리스가 있었을 때 부모의 세포는 4.79 % ± 51.54 %의 최대 중재자 릴리스를 지원했다. 다음 말의 IgE 항 NIP-HSA 감작 및 NIP-HSA 항원 (도 1 B)와 동일한 도전 선택된 세포주. 부모의 세포가 있기 때문에, 중재자 자료를받지 않았다말의 IgE는 내생 쥐 수용체에 결.......

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Discussion

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요약하면,이 조사 결과는 말 FcεRIα 발현 RBL-2H3.1 세포는 항원에 의해 말의 IgE로 감작 및 도전 될 때, 그들은 내부 매개체의 총량 4.88 % ± 36.68 %의 피크 매개체 방출을주는 것으로 나타났다 세포, RBL-2H3.1에 ​​비해 부모의 세포가 말 FcεRIα을 표현하지.

따라서이 분석은 조사하고 체외에서 말 알레르기 반응을 연구하기위한 유용한 도구를 제공합니다. 그는 비만 세포 / 호 염기성 혈통의 세포에 의해 발표 중재자의 양의 결정을 할 수 있으며, 따라서, 말 알레르기에서 연구를 발전 할 것으로 예상 에이전트의 원인이 알레르기를 평가, 또는 차단제의 IgE / 수용체를 연구 여부를 할 수 있습니다.

이 분석은 동일한 목적을 위해 인간과 개 알레르기 4529을 연구하는 데 사용 이전의 출판물에서 말 알레르기를 연구하기 위해 수정되었습니다. 조작 된 세포주인간을.......

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Disclosures

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저자는 이 논문에서 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

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저자는 조언과 실험실 시설을 제공해 준 린다 파트리지(Lynda Partridge) 박사에게 감사를 표한다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
RBL-2H3.1 말 Fc & 엡실론 발현; 리&알파;--실험실에서 생산
말 IgE 반대로 NIP-HSA--실험실에서 생성하는
96 웰 플레이트시그마CLS3595-
멀티 채널 피펫Anachem--
인큐베이터은하 R-
-4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acidCambridge Research BiochemicalsN-1070-1NIP-OH는 실험실에서 NIP-HSA를 만들기 위해 인간 혈청 알부민과 접합
DinitrophenylSigmaA6661약칭 DNP-HSA
플레이트 분광 광도계Anthos Labtec HT2--
파이프SigmaP1851-Sodium
ChlorideSigmaS7653-Potassium
ChlorideSigmaP9333-
염화마그네슘시그마M2670-
염화칼슘시그마C1016-
트리톤 x100시그마X100-4
-니트로페닐 N-아세틸-&베타;-D-글루코사미네이드시그마N9376&베타;-헥소사미니다아제 기질이라고 하는 원액은 DMSO
디메틸 설폭사이드시그마에서 50mM 제조되었습니다.D2650-
구연산시그마251275-
아세트산 나트륨시그마S7670-
트리스시그마T5941-
되는

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taudou, G., et al. Expression of the Alpha Chain of Human FcεRI in Transfected Rat Basophilic Leukemia Cells: Functional Activation after Sensitization with Human Mite-Specific IgE. Int Arch Allergy Immunol. 100 (4), 344-350 (1993).
  2. Sabban, S.

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Equine IgEFc RI ReceptorRat Basophil Leukemia CellsMediator Release AssayBeta Hexosaminidase ReleaseAntigenic ChallengeAllergic ResponseIn Vitro ModelEquine AllergyRBL 2H3 1 Cells

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