Цель этого метода - позволить исследователям выполнять диссекцию, иммуноокрашивание и монтаж куколочных глазных дисков у Drosophila melanogaster любого возраста.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Глазной диск Drosophila melanogaster - это мощная система, которая может быть использована для изучения многих различных биологических процессов. Он содержит около 800 отдельных глазных единиц, называемых омматидиями1. Каждый омматидий содержит восемь нейрональных фоторецепторов, которые развиваются из недифференцированных клеток после прохождения морфогенетической борозды в третьем личиночном возрасте2. После последовательной дифференцировки фоторецепторов развиваются ненейрональные клетки, включая колбочки и пигментные клетки, а также клетки механосенсорной щетины. Процессы окончательной дифференцировки, включая структурированное расположение всех типов омматидиальных клеток, запрограммированную гибель недифференцированных типов клеток и экспрессию родопсина, происходят через фазукуколки 4-7. Эта техника фокусируется на манипуляциях с куколочным диском глаза, обеспечивая понимание и инструкцию о том, как препарировать глазной диск во время фазы куколки, что по своей природе сложнее выполнить, чем обычно расчленяемый диск глаза третьего возраста. Этот метод также предоставляет подробную информацию об иммуноокрашивании, чтобы обеспечить визуализацию различных белков и других клеточных компонентов.
Введение
Поля развития и клеточной биологии были значительно повлияло на модель организма: дрозофилы. В рамках этой модели, исследования диска глазного способствовали большое знаний относительно сигнализации, клеточной биологии и других областях. Покойный третий личиночной диск возрастной стадии глаз хорошо изучена и является мощным модель для использования, так как она дает снимок серии периодов развития, каждый со своими молекулами и процессов уникальный сигнальных, как морфогенетические борозды прогрессирует по диску глаз 8. Тем не менее, существует необходимость дальнейшего расширения нашего понимания процессов развития в куколки фазе развития. В то время как были проведены исследования по куколки глаз диска 3-7, наши знания не подходит широту работы, которая была выполнена на третьем диске возрастной стадии глаз. Это связано, в частности, к большей сложности в рассекает куколки диск глаз. Таким образом, презентациясобственно метод рассечения может значительно расширить научные исследования в этой области.
В то время как есть этапы в рамках развития куколки глаз дисков, которые легко рассеченные, особенно вокруг периода середины куколки, другие временные периоды гораздо более сложной задачей, чтобы рассекать. Этот протокол представляет собой один способ рассечения куколки глаз диски, которые можно повсеместно используемые для всех куколок развития временных рамок. Этот протокол может быть использован в качестве альтернативы другим протоколом 9, который показывает более простой и быстрый метод рассекать глазные диски из midpupal моменты времени. Этот протокол изначально снимается и разработана для подготовки студентов старших курсов бакалавриата в UCLA Бакалавриат исследовательского консорциума в функциональной геномики (URCFG) 10,11 в технике куколки глаз вскрытия. Многие студенты бакалавриата смогли использовать это видео и метод, чтобы узнать эту сложную технику.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Эта процедура представляет собой процедуру, 2 день.
День 1 (2 ч + рассекает время)
1. куколки глаз Диск Рассечение
- Выберите куколку для вскрытия.
ПРИМЕЧАНИЕ: возраст куколки быть расчлененным будет определяться экспериментальным потребностей. Тем не менее, если изучение морфологии клеток, это часто делается на 42 ч после образования пупария (APF) при 25 ° С, что возраст куколок показано на видео. Собирают белый куколки (считается 0 ч APF) с увлажненной кистью и расположить их в хронологическом порядке (в зависимости от времени сбора) в новой муха пищевой флакон, поддерживаемой при 25 ° С. Рассеките возрасте куколки в этом же хронологическом порядке, чтобы сохранить разницу во времени между куколок как можно ближе. - Передача куколки в каплю фосфатно-солевом буфере (PBS, рН 7,4, см материалы для рецепте) на силиконовой пластины вскрытии.
- Держите верхнюю часть куколки случае с пинцетом и проколоть и открыть лАуэр часть куколки случае с парой острых щипцов. Снимите куколку из дела во вновь образовавшуюся дыру.
- Сделайте диагональный срез ножницами, середине грудной клетки, в куколки. Снимите мусора или передавать куколка голову к новому падению PBS. Чистый помощью пипетки с грушей трубку (см материалы и рисунок 1 для деталей) и добавить дополнительную PBS по мере необходимости. Убедитесь, чтобы избежать обезвоживания.
- Надежно возьмитесь за верхнюю часть куколки головы кутикулы с парой щипцов. С помощью кончика трубы воздуходувки, осторожно нажмите на куколки случае выдавливать мозг и другие ткани, в том числе глазных дисков, из куколки случае. Будьте уверены, чтобы избежать захвата любой ткани в кутикулу.
- Использование вентилятора трубку, наполненную PBS, мягко удар жира ткани тела и другой мусор из головы случае четко отделить и идентифицировать мозговые и глазные диски.
Примечание: Ведение мозг, прикрепленный к головной куколки случае позволит использовать исследователь онОбъявление случай как "ручки" для дальнейшего манипулирования ткани, не повреждая глаз диски или мозг. Тем не менее, оно является общим для сместить мозга и глаз диски из головного случае, и это не наносит ущерб общей процедуры и результаты. Это часто занимает несколько попыток дуть и толкает успешно извлекать глазные диски и мозг изнутри куколки случае головки и так, чтобы они четко отделены от окружающих тканей. Чище и отдельный можно получить глазные диски из окружающих тканей поможет предотвратить постороннее ткани от фиксации в глаза дисков. - После вскрытия, немедленно передать ткани на стеклянную посуду 3 скважины на льду с 0,5 мл раствора Фикс (см материалы). Поплавок ткани на поверхности Fix решения в течение нескольких минут (обычно на время, необходимое для рассекать следующий набор глазных дисков).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если это не первый глаз диск, чтобы разрезать в этом раунде рассечение, completelу погрузить предыдущий глаз диск в Fix решения. При выполнении специальных процедур окрашивания (например, активные формы кислорода, лизосом и т.д.) это должно быть сделано до фиксации. Для того чтобы сделать это, хранить расчлененный глазные диски в ледяной PBS до продолжения соответствующего протокола окрашивания. - После вскрытия и погружение всех глазных дисков, которые расчленены, переместите стекло блюдо 3 а к рокера и рок при комнатной температуре в течение 30 мин.
2. Иммуноокрашивание
- Осторожно снимите Fix решение и добавить 0,5 мл PBS с 0,3% Triton X-100 (0,3% PBT, ознакомиться с материалами) и мыть ткань на кресле-качалке в течение 10 мин. Повторите этот шаг еще три раза в общей сложности 4 стирок (10 мин каждый).
ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательное удаление раствора из скважины может быть выполнена под микроскопом рассекает чтобы предотвратить повреждение тканей или потери. Решение может быть атмосферный тщательно пипеткой; мы предпочитаем тонкую tippeд, одноразовые передачи пипетки, что была на открытии сплющенный уменьшить шанс аспирационных ткани. - В конце 4-й стирки, мыть удалить и добавить 0,5 мл раствора блок (см материалы) в лунку и инкубировать в течение 30 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: этот период времени может быть продлен в соответствии с вашими потребностями. - В конце времени блока 30 мин, пипетки 10 мкл первичного антитела раствора (разбавленного раствора в блок) в соответствующее числу скважин в планшете.
ПРИМЕЧАНИЕ: Один лунку планшете будет разместить около 4 пары глаз дисков, подключенных к куколки случае или 8 изолированных пар глаз дисков с мозгами прилагается. В качестве первичных антител в этом протоколе для репрезентативных данных являются анти-фосфотирозина (1: 500 разведение) и анти-Cut (1: 200 разведение). - Перенести расчлененный ткани в планшете скважин, заполненных промывочной первичного антитела Решение от стеклянной посуде 3 а.
- Местопланшета дл смачиваемой на бумажное полотенце (чтобы предотвратить обезвоживание) в качестве наконечника пипетки поле пустым (или другого подобного контейнера) и хранят при температуре 4 ° С в течение ночи.
День 2 (4 ч + монтаж время)
- Передача ткани из планшете к новому стеклянную посуду 3 скважины с 0,3% PBT (≈0.5 мл) и промывают ткань в течение 10 мин на качалке. Повторите этот шаг еще три раза в общей сложности 4 стирок (10 мин каждый)
- Удалить последнюю стирку и добавить 0,5 мл раствора Блок к колодцу. Блок в течение 30 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: этот период времени может быть продлен в соответствии с вашими потребностями. - Удаление раствора Block и добавить 0,5 мл раствора вторичного антитела (из флуоресцентно меченых антител, соответствующих вашей первичного антитела и длина волны флуоресценции, разведенного в растворе блок) на лунку и защитить стеклянную посуду 3 также от света с крышкой или алюминия фольга и инкубировать в течение по крайней мере 2 ч при комнатнойТемпература.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие шаги должны быть так же защищены от воздействия света. Это инкубирование может быть продолжено в течение ночи при 4 ° С, в установке, подобной первичной инкубации антитела, но она также может быть выполнена в стеклянной чашке 3 хорошо покрыты лабораторной пленкой, или планшете, если сохранение желаемого антитела. - В конце инкубации антител, удалить вторичным антителом решение и добавить 0,5 мл 0,3% PBT к колодцу и мыть на качалке в течение 10 мин. Повторите этот шаг для в общей сложности 4 стирок (10 мин каждый).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если окрашивание DAPI желательно, перед началом первой стирки, добавить 0,5 мкл DAPI раствора (см материалы) к 500 мкл PBT, которые будут использоваться для первой стирки (1: 1000 разбавления).
3. Монтаж
- В конце последней стирки, монтировать усиков / глаз диски на слайде, используя 70% глицерина или PBS в качестве среды для удаления брAin и других нежелательных тканей в бассейне на одной стороне слайда.
- Осторожно переместить ткань с использованием гидростатического давления между щипцов, или очень аккуратно с наконечником щипцов, и выстраиваются глазные диски в колонну по направлению к центру слайда.
- Удалите все посторонние глицерин или PBS со всего ткани (используя влагу действие лаборатории салфеткой или щипцы работать для этого).
- Поместите небольшое количество (≈10 мкл) из монтажной среды вдоль одной стороны колонны глаз диска и поместить на покровное ткани таким образом, чтобы распространить монтажную среду на глаз дисков.
- Пусть слайд сидеть за 1 до 2 мин, чтобы ткань / монтажа средних распространяться полностью.
- Протрите каких-либо дополнительных крепления среду от от по краям покровного стекла и запечатать его с прозрачным лаком для ногтей.
- Захват флуоресцентные изображения глаз диски с использованием конфокальной микроскопии.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В качестве примера использования этого протокола, иллюстрирующая результаты midpupal (42 ч АПФ при 25 ° С) глазные диски иммунному окрашиванию с различными антителами представлены на рисунке 2. С помощью антитело, направленное против фосфотирозиновых остатков, мембрана из клеток может быть Наблюдаемый (2А). Это может быть использовано, чтобы определить правильное расположение ommatidial клеток в куколки глаза, следующий за последним процессов, происходящих паттерна до midpupal стадии. Еще один представи...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Хотя кажется, что процесс прост и легок в исполнении, на самом деле эта техника требует большой практики для освоения. Как правило, мы начинаем обучение студентов с того, что учимся препарировать и монтировать диски глазатретьего возраста 12, с которыми гораздо легче работать. Эта практика помогает выработать соответствующее положение рассечения рук, кистей и пальцев13 , чтобы манипуляции с щипцами под рассекающим микроскопом были стабильными, легкими и опытными. По сути, период практики должен д...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы ценим и хотели бы поблагодарить Медицинский институт Говарда Хьюза за награду профессора HHMI для U.B., которая сделала этот проект возможным. Мы благодарим колледж при Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе за предоставление помещений и поддержки учебной инфраструктуры для этой работы. Работа также была поддержана финансированием Университета Среднего Запада и щедрым пожертвованием от благотворительного фонда Fidelity Gift Fund. Мы благодарим Джона ВанденБрукса за комментарии к рукописи и Кристу Пирман за ее техническую помощь.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Фосфатно-солевой буфер (PBS, pH 7,4) | 80 г NaCl, 2г KCl, 14,4 г Na2HPO4, 2,4 г KH2PO4, довести объем до 1 μ l, отрегулируйте pH до 7,4, стерилизуйте автоклавом или фильтром, разбавьте до 1x PBS автоклавным ddH2O перед использованием. | ||
| Triton X-100 | Promega | H5142 | Внимание: Раздражает! Надевайте перчатки. |
| 0,3% ПБТ | 1,5 мл Тритон Х-100, 500 мл 1Х ПБС. | ||
| 37% раствор формальдегида | Fisher Scientific | F75P1GAL | Внимание: Токсичный, вероятный канцероген для человека! Наденьте перчатки. |
| Fix Solution | (≈ 4% формальдегида в PBS) 50 мкм; л 37% формальдегида, 450 μ l 1x PBS, сделать свежим перед использованием | ||
| Нормальная козья сыворотка | антитела Rockland и анализы | B304 | Аликвота в объемах 1 мл и хранить при -80 ° Раствор C |
| Block 10 | % NGS в PBT. Это можно сделать и хранить при 4°°; C за несколько дней до использования. | ||
| DAPI стоковый раствор | Life Technologies | D3571 | Для окрашивания ядер. Приготовьте раствор 1 мг/мл с ddH2O. |
| VectaShield Монтажная среда | Vector Labs | H-1000 | Монтажная среда |
| Глицерин | Sigma | G5516 | Для монтажа. Приготовьте 70% разведение с ddH2O. |
| Оборудование | |||
| Смеситель для накидки | VWR | 82007-202 | Используется для создания ткани в стеклянной чашке на 3 лунки |
| SylGard 182 Набор силиконовых эластомеров | Krayden | NC9897184 | Используется для изготовления силиконовой тарелки для препарирования |
| Силиконовая тарелка | для препарированияАккуратно смешайте набор эластомеров Sylgard (выше) в соответствии с инструкциями (во избежание образования пузырей). Вылейте смесь в чашку Петри (любого размера). Дайте SylGard затвердеть за ночь через 37 градусов; С инкубатором. | ||
| 3-луночная стеклянная тарелка | Corning | 7220-85 | Разновидность 3-луночных из них больше не доступна, это 9-луночный продукт. |
| 72 лунки микролуночный мини-лоток | Nunc | 438733 | |
| Острые щипцы (Dumont #55) | Инструменты для тонкой науки | 11255-20 | |
| Микроножницы типа Vannas, прямые, лезвие 5 мм | Ted Pella | 1346 | |
| 100 мм капилляры из боросиликатного стекла | World Precision Instruments | 1B100-4 | Потяните с помощью иглы для создания тонкого кончика, который позволяет небольшой струе PBS течь. |
| Одноразовые передаточные пипетки, тонкий наконечник | Samco Scientific | 231 | |
| Указанные размеры трубки: внутренний диаметр (ID) x внешний диаметр (OD) x толщина стенки в дюймах | |||
| Трубка из ПВХ (1/8 x 3/16 x 1/32) | Nalgene | 8000-0010 | Используйте их с вытянутой иглой для сборки трубки воздуходувки, как показано на рисунке 2. |
| Силиконовая трубка Tygon (3/32 x 5/32 x 1/32) | Высококачественные пластмассы Saint Gobain | ABW00004 | |
| силиконовые трубки Tygon (1/32 x 3/32 x 1/32) | Высокоэффективные пластмассы Saint Gobain | ABW00001 |
Ссылки
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113 (3), 841-850 (1991).
- Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).
- Bao, S., Cagan, R. Preferential adhesion mediated by Hibris and Roughest regulates morphogenesis and patterning in the Drosophila eye. Dev cell. 8 (6), 925-935 (2005).
- Grzeschik, N. A., Knust, E. IrreC/rst-mediated cell sorting during Drosophila pupal eye development depends on proper localisation of DE-cadherin. Development. 132 (9), 2035-2045 (2005).
- Sprecher, S. G., Desplan, C. Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons. Nature. 454 (7203), 533-537 (2008).
- Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40 (4), 851-858 (1985).
- Voas, M. G., Rebay, I. Signal integration during development: insights from the Drosophila eye. Dev Dyn. 229 (1), 162-175 (2004).
- Hsiao, H. Y., et al. Dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult Drosophila retinas. J Vis Exp. , 4347(2012).
- Call, G. B., et al. Genomewide clonal analysis of lethal mutations in the Drosophila melanogaster eye: comparison of the X chromosome and autosomes. Genetics. 177 (2), 689-697 (2007).
- Chen, J., et al. Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers. PLoS Biol. 3 (2), 59(2005).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. 37, 1936(2010).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
