L'obiettivo di questo protocollo è quello di delineare un approccio chirurgico per fornire un accesso diretto al nucleo cocleare dorsale in un modello murino.
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Articolo metodologico
Visualizzazione diretta del Murine Dorsale Cochlear Nucleus per optogenetic stimolazione del percorso uditivo
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Indagine sull'uso di trasferimento genico virus-mediata di arrestare o invertire la perdita dell'udito è stata in gran parte relegato al sistema uditivo periferico. Pochi studi hanno esaminato il trasferimento di geni al sistema uditivo centrale. Il nucleo dorsale cocleare (DCN) del tronco encefalico, che contiene neuroni secondo ordine del percorso uditivo, è un sito di capacità di trasferimento genico. In questo protocollo, una tecnica per l'esposizione diretta e massima della murino DCN mediante un approccio posteriore fossa è dimostrata. Questo approccio permette sia per la chirurgia acuta o sopravvivenza. Dopo la visualizzazione diretta del DCN, una serie di esperimenti sono possibili, compresa l'iniezione di opsine nel nucleo cocleare e la stimolazione successiva da una fibra ottica accoppiata ad un laser a luce blu. Altri esperimenti di neurofisiologia, come la stimolazione elettrica e tracciati iniettori neurali sono anche possibili. Il livello di Visualizazione e la durata della stimolazione rendono realizzabile questo approccio applicabile ad una vasta gamma di esperimenti.
Introduzione
Il trasferimento genico mediato dal virus per invertire la perdita dell'udito si è concentrato in gran parte sul sistema uditivo periferico. 1 Per colpire la coclea, i ricercatori hanno esaminato una serie di vie di somministrazione, tra cui l'infusione osmoticacon minipompa 2, il Gelfoam®2 imbevuto di complesso vettore-transgene o la spugna di gelatina3, la microiniezione diretta4; numerosi vettori di trasferimento genico, tra cui i vettori virali adeno-associati5,6, i vettori lentivirali7 e i liposomi cationici2; e la disseminazione di vettori di trasferimento genico oltre il tes....
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Protocollo
NOTA: Tutte le procedure sperimentali sono eseguite in conformità con la cura e l'uso degli animali Comitato del Massachusetts Eye and Ear Infirmary e Harvard Medical School, che seguono le linee guida nazionali per la cura degli animali, tra cui la politica di sanità pubblica Service Humane cura e l'uso di animali da laboratorio, la ILAR Guida, e la legge sulla protezione degli animali. Procedure sperimentali elencate di seguito dettagliato esposizione della DCN di sinistra. Usare strumenti sterili durante l'esecuzione di un intervento chirurgico di sopravvivenza.
1. primario Craniotomia e dorsale cocleare Nucleus Esposizione
- Anestesia....
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Risultati
Parziale cerebellare aspirazione possa accedere alla Cochlear Nucleus
Dopo la pelle ei muscoli sovrastante il cranio vengono rimossi, monumenti superficie del cranio, come le linee di sutura coronale e Lamda, dimostrano la localizzazione approssimativa della craniotomia. A seguito di craniotomia con rongeurs, il cervelletto è visualizzato. Accurata aspirazione della piccola porzione del cervelletto dimostra visualizzazione della NC, che possono poi essere iniettato (Figura 1.......
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Discussione
Questo documento descrive la tecnica di visualizzazione diretta del DCN nel modello murino per la manipolazione del sistema uditivo centrale. L'approccio delineato di visualizzazione diretta offre notevoli vantaggi rispetto l'alternativa principale, che sono approcci stereotassica. In primo luogo, la visualizzazione diretta della DCN consente conferma immediata del sito del tronco encefalico, considerando approcci stereotassica non danno visualizzazione diretta. In esperimenti che necessitano prolungati periodi .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Finanziamento: Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della Fondazione Bertarelli (DJL), una borsa di MED-EL (DJL), e un National Institutes of Health sovvenzioni DC01089 (MCB).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Supporto stereotassico | Stoelting | 51500 | |
| Coperta omeotermica | Harvard | 507214 | |
| Lama per bisturi #11 | Strumenti chirurgici fini | 10011-00 | |
| Forbice per iride | Strumenti chirurgici fini | 14084-08 | |
| 5 Aspirazione francese | Simmetria Chirurgica | 2777914 | |
| Punti dentali | Henry Schein | 100-8170 | |
| Rongeur | Strumenti chirurgici di precisione | 16020-14 | |
| 10 µ l Siringa Hamilton | Hamilton | 7633-01 | |
| Calibro 34, ago | Hamilton | ||
| Rongeurs | Strumenti chirurgici di precisione | 16021-14 |
Riferimenti
- Lalwani, A., Mhatre, A. Cochlear gene therapy. Ear Hear. 24 (4), 342-348 (2003).
- Lalwani, A., Jero, J., Mhatre, A. Current issues in cochlear gene transfer. Audiol Neurootol. 7 (3), 146-151 (2002).
- Jero, J., et al.
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Ristampe e permessi
