使用荧光蛋白进行多重应用的遗传条形码技术

摘要

自从发现绿色荧光蛋白基因以来，荧光蛋白已对分子细胞生物学产生了深远影响。本实验方案描述了如何通过基因工程表达不同的荧光蛋白，从而实现对单个细胞的条形码标记。该方法可用于追踪细胞混合物中的不同细胞群体，特别适用于多重化应用。

摘要

荧光蛋白、荧光染料以及一般的荧光基团已经彻底改变了分子细胞生物学领域。特别是荧光蛋白及其基因的发现，使得研究人员能够构建用于定位的融合蛋白，分析目的蛋白的转录激活与翻译过程，或对单个细胞及细胞群体进行普遍示踪。将荧光蛋白基因与逆转录病毒技术相结合，进一步实现了这些蛋白在哺乳动物细胞中稳定且可靠的表达。本文展示了如何利用这些基因赋予细胞群体中各个细胞独特的生物条形码。由于该生物条形码通过逆转录病毒技术实现，因此细胞的标记是“永久性”的。因此，可在混合的条形码细胞中对各个细胞进行独立追踪，并将其应用于更复杂的生物学研究中。在细胞混合物中追踪不同细胞群体的方法特别适用于多重化应用，例如针对多个靶点的药物筛选，或不同启动子的激活谱分析。本实验方案详细描述了如何高效地构建并扩增带有不同遗传性荧光标记的条形码哺乳动物细胞，以及如何同时使用多个标记，或以不同强度使用单一标记。最后，本方案还阐述了如何将这些细胞进一步结合基于细胞的检测方法，通过多重化分析提升研究效能。

引言

荧光光谱技术、荧光显微镜技术和流式细胞术等均依赖于荧光现象，而荧光在生物化学、生物医学和化学应用中被广泛利用。无论是内源性荧光还是通过标记产生的荧光，均已用于分析蛋白质表达模式与表达谱、细胞命运、蛋白质相互作用及生物学功能^1-9，并通过荧光/福斯特共振能量转移（FRET）技术用于检测生物大分子间的相互作用及构象变化^10-13。自从分离出Aequorea victoria的绿色荧光蛋白（GFP）¹⁴以来，研究人员又从其他刺胞动物（尤其是珊瑚）中发现了更多天然存在的荧光蛋白，显著增加了具有可区分激发/发射光谱的荧光蛋白种类。此外，通过对这些蛋白基因引入突变^15-19，进一步拓展了其应用可能性，使科学家能够获得一系列真正的荧光蛋白工具，广泛应用于显微成像、流式细胞分析及其他基于荧光的技术研究中。

与此同时，尽管是独立发展，逆转录病毒技术的进步极大地促进了外源遗传信息在哺乳动物细胞中的稳定表达^20-23。因此，该技术被广泛用于将荧光蛋白基因导入多种细胞类型和组织^24-28，或用于制备转基因动物^29-31，也就不足为奇了。根据逆转录病毒的特性，外源荧光蛋白的遗传信息被整合至细胞基因组中³²，从而使细胞实现永久性荧光标记。这一特性使得研究人员能够追踪细胞命运，或在一群细胞中追踪单个细胞。此时，该荧....

方案

1. 用于基因条形码技术的哺乳动物细胞准备、病毒生产及转导

1. 接种 2.5 × 10⁶ 转染前一天，在含10%胎牛血清（FCS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养贴壁细胞至10 cm培养皿中（或细胞汇合度约为50–60%）。为生产逆转录病毒，可选用合适的包装细胞系，例如Phoenix-GP细胞系（由斯坦福大学Gary Nolan惠赠）。
   注意：包装细胞系稳定表达用于逆转录病毒颗粒形成的 Gag 和 Pol 蛋白 在转染中确保转染前细胞状态良好，并以单层形式贴壁生长在培养板上。
2. 24小时后，制备DNA转染混合物。
   1. 向 125 μl 无血清 DMEM 培养基中加入 3 μg 水疱性口炎病毒包膜糖蛋白载体（pCI-VSVg）和 3 μg 携带目的荧光蛋白基因的转移载体。混匀后加入 15 μl 聚乙烯亚胺（2 mg/ml）。
   2. 室温孵育混合物15分钟，然后逐滴加入细胞中。
      注意：聚乙烯亚胺作为转染试剂加入均质DNA混合物中，以形成聚复合物。为获得携带不同荧光蛋白标记的病毒颗粒，需针对所选标记物分别进行独立转染。需注意逆转录病毒转移载体长度约为7 kb，若超过10 kb则无法被有效包装。
3. 在37 °C条件下孵育培养板。为提高病毒产量，可将培养板置于30 °C或32 °C条件下孵育。
   注意：转染后24小时，可将培养基更换为....

结果

为了实现生物学应用中的多重检测，必须首先生成独立的克隆细胞群体。当带有条形码的细胞群体具有清晰且互不重叠的荧光特征时，多重检测的效果最佳。图1展示了哺乳动物SupT1细胞克隆群体的示例，说明表达mCherry和青色荧光蛋白（CFP）的条形码细胞可被同时分析，而不会丧失各自的荧光特性。因此，该矩阵展示了一组可用于多重生物学应用的荧光基因条形码细胞，且仍可在另一个可用检测通道中进行读数。为获得此类细胞组合，需牢记逆转录病毒技术的特性，该技术会因插入位点效应和/或感染复数（MOI）导致群体内荧光强度存在较大差异。图2显示，使用携带tdTomato或E2Crimson的病毒颗粒对哺乳动物细胞进行初始转导后，细胞表达一种或两种荧光蛋白的强度范围较广（左图）。如门控框所示，将单个细胞分选至96孔板中（中图），可在扩增后获得均一的克隆群体（右图）。均一性群体应具有较小的变异系数（CV），其具体数值因细胞类型而异，通常在平均荧光强度上的CV为30-40%。图2还表明，即使仅使用两种荧光蛋白构建矩阵，也可通过利用荧光强度差异进一步增加基因条形码群体的数量.......

讨论

本文结合了两种成熟的技术：通过逆转录病毒技术进行基因工程改造，以及利用流式细胞术检测荧光蛋白。基于荧光蛋白的遗传条形码技术可用于构建独特的细胞系，为多重应用提供了一种稳健且简便的方法。通过逆转录病毒技术生成带有遗传条形码的工程化细胞最初是一个耗时较长的过程，但一旦建立成功，便可获得稳定可靠的细胞材料来源。该技术能够持续产生具有稳定荧光特性的基因工程细胞系，这些稳定的荧光特征即成为每种细胞独有的、可明确区分的生物标记。

利用基于其物理吸收/发射光谱易于区分的荧光蛋白，可对贴壁和非贴壁细胞类型进行条形码标记。这些荧光蛋白包括但不限于CFP、mCherry、E2 Crimson和tdTomato。一旦通过可区分的荧光蛋白进行遗传条形码标记，这些细胞即可混合，形成一组细胞群体。重要的是，该组细胞群体具有完全相同的基因型组成，仅在荧光特性上有所区别。因此，这类细胞组合非常适用于多重检测应用，可显著提高高通量分析能力。

由于逆转录病毒颗粒在插入宿主基因组时具有不同的插入偏好，加之感染复数（MOI）的差异，所携带的特定荧光蛋白基因产生的荧光.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 ml 注射器	BD	309604	用于过滤病毒
0.45 µm 聚四氟乙烯滤器	Pall Corporation	4219	用于过滤病毒
DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）	Corning	45000-304	HEK 293T 细胞的细胞生长培养基
PEI（聚乙烯亚胺）	Poly Sciences	23966-2	使用浓度为 2 mg/ml
水平转子离心机（带制冷）	Eppendorf	5805 000.017	用于离心感染
PBS（磷酸盐缓冲液）	Corning	21-040-CV	用于细胞洗涤
Polybrene（六亚甲基双溴化铵）	Sigma-Aldrich	107689	用于提高病毒感染效率，使用浓度为 5 µg/ml。
FACSAria	BD Biosciences		用于细胞群体分选的仪器
FACSCanto	BD Biosciences		用于细胞分析的仪器
Phoenix-GP	由 Gary Nolan 惠赠		用于产生逆转录病毒颗粒的细胞系
胎牛血清	Mediatech	MT35015CV	用于细胞生长和分选
SupT1 细胞	ATCC	CRL-1942	人 T 淋巴母细胞
HEK 293T 细胞	ATCC	CRL-11268	人胚胎肾细胞，同时含有 SV40 大 T 抗原
RPMI 1640	Corning	10-040-CV	SupT1 细胞的细胞生长培养基