Method Article

العزلة والثقافة وطويل الأجل صيانة الابتدائية الدماغ المتوسط ​​الدوبامين العصبية من المخ الجنينية القوارض

DOI:

10.3791/52475

⸱

February 19th, 2015

 ,  ,  , 
1Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London, 2Department of Neurosurgery, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3Department of Internal Medicine, Endocrinology, Yale University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أسباب تنكس الخلايا العصبية الدوبامين في الدماغ الأوسط أثناء مرض باركنسون غير مفهومة تماما. توفر أنظمة الثقافة الخلوية أداة أساسية لدراسة الخصائص الفيزيولوجية العصبية لهذه الخلايا العصبية. نقدم هنا بروتوكولا محسنا ، والذي يمكن استخدامه للنمذجة المختبرية للتنكس العصبي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنكس الخلايا العصبية الدوبامين المتوسطة (mesDA) هو السمة المميزة المرضية لمرض باركنسون. إن دراسة العمليات البيولوجية التي تنطوي عليها الوظائف الفسيولوجية وضعف هذه الخلايا العصبية وموتها أمر لا يقاوي لفهم الأسباب الكامنة وكشف علاج هذا الاضطراب التنكسي العصبي الشائع. توفر الثقافات الأولية للخلايا العصبية mesDA أداة للتحقيق في الخصائص الجزيئية والكيميائية الحيوية والفيزيولوجية الكهربية ، من أجل فهم تطور هذه الخلايا العصبية وبقائها على المدى الطويل وتنكس أثناء المرض. نقدم هنا طريقة مفصلة لعزل وزراعة وصيانة الخلايا العصبية الدوبامين في الدماغ المتوسط من أجنة الفأر E12.5 (أو الفئران E14.5). تؤدي ظروف زراعة الخلايا المحسنة في هذا البروتوكول إلى وجود إسقاطات محورية وتغصنية ووصلات متشابكة وخصائص مورفولوجية عصبية أخرى ، مما يجعل الثقافات مناسبة لدراسة الخصائص الفسيولوجية والبيولوجية والجزيئية للخلايا لهذه المجموعة العصبية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فقدان الخلايا العصبية الدوبامين من المادة السوداء بارس المكتنزة يؤدي إلى أعراض الكاردينال السيارات من مرض باركنسون (PD)، والثاني اضطراب الاعصاب الأكثر انتشارا. السبب الكامن وراء زوال هذه الفئة من السكان الخلايا العصبية الدماغي المتوسط ​​غير معروف. لدراسة المسارات البيوكيميائية المسؤولة عن تطوير وتحوير الخصائص الفسيولوجية العصبية وبقاء الخلايا العصبية mesDA، عدة زراعة الخلايا والنظم نموذج حيواني استخدمت. خطوط الخلايا خلده، بما في ذلك الدوبامين الفئران خط الخلية 1RB 3 AN 27 (N27)، والدوبامين البشري خط الخلية العصبية SH-SY5Y، الماوس الدوبامين خط الخلية المختلطة MN9D والدماغ المتوسط ​​البشري LUHMES خلايا استخد....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تم الحفاظ على الحيوانات والتعامل معها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية وجميع الإجراءات الحيوانية وافق عليها رعاية الحيوان في جامعة Imperial College والجسم المراجعة الأخلاقية (AWERB) وزارة الداخلية وجامعة هارفارد المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC)، في الامتثال للوائح الفيدرالية وحكومات الولايات.

1. الكاشف وإعداد المعدات

  1. ذوبان الجليد، قسامة وتخزين 1 ملغ / مل Laminin الحل في -80 درجة مئوية. حل 2 ميكرولتر في 1 مل DMEM / F12، مما أدى إلى تركيز طلاء من 1-2 ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المناعية ضد التيروسين هيدروكسيلاز (ث) تبين أن بين 0.5-1٪ من الخلايا في الثقافة هي الدوبامين. ويبدو أن التوقعات العصبية في غضون 2 ساعة بعد الطلاء وقبل اليوم الأول، ومحاور عصبية والتشعبات هي تمييزها (الشكل 2)، وذلك باستخدام هيدروكسيلاز التيروزين (TH) والبروتين (2 MAP2) الأجسام المضادة المرتبطة أنيبيب (الشكل 3). الخلايا العصبية البقاء على قيد الحياة لأكثر من ستة أسابيع وتظهر ثمرة واسعة النطاق. نسبة الخلايا العصبية، الدبقية في الثقافات ويرتبط مباشرة إ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا العصبية الدوبامين في المخ الأوسط هي المصدر الرئيسي الدوبامين في الجهاز العصبي المركزي. وهي تنقسم إلى ثلاث مجموعات، بارس المادة السوداء المكتنزة (SNpc)، المنطقة البطنية السقيفية (VTA) والميدان retrorubral (قوة الرد السريع) 10، 11. الخلايا العصبية في SNpc وVTA تؤدي إلى مسارات الدوبامين الرئيسية، mesocortical، mesolimbic وnigro-مخططي، والمشاركة في وظائف مثل السيطرة على المشاعر والدوافع والسلوك الحركي. زوال الخلايا العصبية في SNpc واضطراب وظيفي للنظام السوداوي المخط.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ هذا العمل باستخدام قسم علوم الدماغ ، قسم الطب ، أموال بدء التشغيل في إمبريال كوليدج لندن إلى KNA.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
خليط المغذيات المتوسطة من Dulbecco المعدل F-12Invitrogen11330
محلول الملح المتوازن هانكس (HBSS) (1X) ، مصل سائلInvitrogen24020-117
، معطل بالحرارة (FBS) مكملInvitrogen16140
N2 (100X) ، سائلInvitrogen17502-048
D- (+) - جلوكوز محلول (45٪ (بالوزن / حجم) في الماءSigmaG8769
ألبومين مصل الأبقار BSASigmaA9430
Laminin من Engelbreth-Holm-Swarm غشاء القاعدي لساركوما الفئرانSigmaL2020
البنسلين / الستربتومايسينInvitrogen15070
التربسين (0.05٪ (بالوزن / الحجم)Invitrogen25300
مصل بقري تم اختبار ثقافة الخلايا الألبومين (BSA) Sigma A9418
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)سيجماP3813
الأجسام المضادة للتيروزين هيدروكسيلاز (Th)بيل فريز بيولوجيزP60101-0  ؛
بولي إل أورنيثين ، محلول 0.01٪سيجماP4957
Anti-Map2 (البروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة -2A و -2B) الجسم المضادMilliporeMAB3418
الأجسام المضادة للسينابسين -1MilliporeAB1543P
Alexa Fluor 488 الحمار المضاد للأرانب IgG & nbsp ؛   مجسات جزيئية للأجسام المضادةA-21206
Alexa Fluor 594 حمار مضاد للأرانب IgG & nbsp ؛   مجسات جزيئية للأجسام المضادةA-21207
Alexa Fluor 488 حمار مضاد للأغنام IgG & nbsp ؛   مجسات جزيئية للأجسام المضادةA-11015
Alexa Fluor 594 حمار مضاد للأغنام IgG & nbsp ؛   مجسات جزيئية للأجسام المضادةA-11016
Alexa Fluor 594 حمار مضاد للفأر IgG & nbsp ؛   مجسات جزيئية للأجسام المضادةA-21203
محلول تريبان الأزرق (0.4٪ (بالوزن / الحجم))Biowhittaker17-942E
مجهر ستيريوكارل زايسستيمي 2000-C
مجهر تباين الطور المقلوبكارل زايسأكسيفرت 40 C
ملقط دومونأدوات علمية دقيقةمايو -45
غطاء ملقط الانزلاق – DumoxelFine ScientificTools 11251-33
Two Dumont # 45 Fallps &ndash ؛ DumoxelFine ScientificTools 11245-30
حامل شفرة / قاطع قبضة مسطحة -أدوات علمية دقيقة11 سم 10052-11
مقص سوسن الطالب - مستقيم 11.5 سمأدوات علمية دقيقة91460-11
هالوجين من الألياف البصريةنيكونMKII
زجاج البورسليكات القابل للتصرف ماصاتFisherbrand13-678-20C
مقياس الدمProscitechSVZ2NIOU
0.2 & micro ؛ م وحدات تصفية معقمةNalgeneNL-CE-156-4020
100x20 مم أطباق بتريBD Biosciences351005
غطاء دائري زلة # 1 سمك زجاج ألماني 12 ممزجاج بيلكو1943-10012   ؛
إضاءة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prasad, K. N., et al. Establishment and characterization of immortalized clonal cell lines from fetal rat mesencephalic tissue. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30A, 596-603 (1994).
  2. Fall, C. P., Bennett, J. P.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mesencephalic Dopaminergic NeuronsPrimary Neuron CultureVentral Midbrain DissectionTissue DissociationImmunofluorescence MicroscopyTyrosine Hydroxylase StainingCell Viability AssayCover Slip PreparationLaminin CoatingLong Term Neuron Maintenance

Related Articles