نقدم هنا تقنيات لتصوير أحداث Ca2+ المحلية بوساطةIP 3 باستخدام المجهر الفلوري في خلايا الثدييات السليمة المحملة بمؤشرات Ca2 + جنبا إلى جنب مع خوارزمية تعمل على أتمتة تحديد وتحليل هذه الأحداث.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
عصاري خلوي كا 2+ أيونات تنظم جوانب عديدة من النشاط الخلوي في جميع أنواع الخلايا تقريبا، والعمليات كما واسع النطاق كما النسخ الجيني، استثارة الكهربائية وتكاثر الخلايا السيطرة. تنوع وخصوصية الكالسيوم 2+ إشارات مستمد من الآليات التي يتم إنشاؤها الكالسيوم 2+ إشارات للعمل على نطاقات زمنية ومكانية مختلفة، بدءا من التذبذبات على مستوى الخلية وموجات تحدث خلال فترات دقيقة لمحلية عابرة الكالسيوم 2+ microdomains (الكالسيوم 2+ نفث) ميلي ثانية دائمة. تضاعفت التطورات الحديثة في الإلكترون CCD (EMCCD) الكاميرات تسمح الآن للتصوير من الكالسيوم المحلية 2+ الإشارات مع قرار المكاني 128 × 128 بكسل وفقا لأسعار> 500 لقطة في الثانية -1 (إطارا في الثانية). هذا النهج هو مواز للغاية ويمكن رصد في وقت واحد من مئات القنوات أو المواقع نفخة في تجربة واحدة. ومع ذلك، فإن كميات هائلة من البيانات ولدت (حوالي 1 غيغابايت بيص دقيقة) تجعل التعرف البصري وتحليل الكالسيوم المحلي 2+ الأحداث عملي. نحن هنا وصف وشرح إجراءات الاستحواذ، والكشف، وتحليل IP المحلي 3 بوساطة الكالسيوم 2+ الإشارات في خلايا الثدييات سليمة محملة الكالسيوم 2+ المؤشرات باستخدام كل واسعة المجال برنامج التحصين الموسع ومضان (WF) والانعكاس الكلي الداخلي مضان (TIRF) المجهري. وعلاوة على ذلك، نحن تصف خوارزمية وضعت داخل المصدر المفتوح البرمجيات بيثون البيئة بأتمتة تحديد وتحليل هذه الكالسيوم 2+ إشارات المحلية. الخوارزمية يموضع مواقع الكالسيوم 2+ الإفراج لقرار الفرعي بكسل. يسمح للمستخدم باستعراض البيانات؛ والنواتج متواليات وقت إشارات نسبة مضان جنبا إلى جنب مع السعة والبيانات الحركية في جدول Excel متوافق مع.
المقدمة
أيونات الكالسيوم (الكالسيوم 2+) تنظيم بتواجد مطلق مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية، بما في ذلك التعبير الجيني، إفراز وتغييرات طويلة الأمد في اللدونة متشابك 1. طريقة واحدة يمكن من خلالها الكالسيوم 2+ يمكن أن تعمل بطريقة مختلفة يتم من خلال أنماط المكانية والزمانية مختلفة من الكالسيوم 2+ اشارات يمكن خلية تولد. على سبيل المثال الارتفاعات العالمية في عصاري خلوي [كا 2+] انكماش الزناد في أنسجة العضلات الملساء 2 في حين أن أصغر، ارتفاعات عابرة مترجم (المحلية الكالسيوم 2+ microdomains) تحفيز التعبير الجيني أساسي للتعلم والذاكرة 3.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
نقدم إجراءات تفصيلية لتصوير المحلية الكالسيوم 2+ الأحداث في العصبية البشري خلايا SH-SY5Y. ويمكن تكييف هذه الإجراءات لصورة الكالسيوم داخل الخلايا 2+ إشارات في العديد من أنواع الخلايا 8-10.
1. إعداد الخلايا
- ثقافة الخلايا ليتم تصويرها وفقا لتعليمات المدرجة على المورد الخاصة بهم على شبكة الإنترنت.
- بضعة أيام قبل التصوير، وخلايا الحصاد نمت في قارورة زراعة الأنسجة باستخدام 1 مل من 0.25٪ التربسين ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الشكل 1A يظهر صورة WF من الراحة كال-520 مضان في الخلايا العصبية SH-SY5Y الإنسان أيضا محملة CI-IP 3. تعرض هذه الخلايا إلى ومضة 100 مللي ثانية الأشعة فوق البنفسجية إلى الصورة الإفراج ط-IP 3 أثارت عابرة الكالسيوم 2+ نفث في مواقع منفصلة (لاحظ الدوائر البيضاء في الشكل 1A). وأظهرت آثار مضان تقاس في هذه المواقع مرحلة ارتفاع السريعة بسبب الفتحات عابرة للIP 3 روبية، تليها طور السقوط أبطأ بكثير (1B الشكل و.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نحن هنا وصف البروتوكولات لتصوير المحلية الكالسيوم 2+ الأحداث في خلايا الثدييات مثقف باستخدام الكالسيوم الفلورسنت 2+ المؤشرات. وعلاوة على ذلك، نحن تصف خوارزمية مع واجهة مستخدم بديهية بأتمتة تحديد وتحليل البيانات التي حصل عليها. الإجراء الموضح هنا الاستفادة من الفلورسنت الكالسيوم 2+ مؤشر كال-520، ولكن العديد من الكالسيوم 2+ الأصباغ الأخرى الحساسة مثل فلوو-3، فلوو-4، فلوو-8 وأوريغون الخضراء BAPTA-1 أداء جيدا بما فيه الكفاية لصورة الكالسيوم .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة 100201 GM إلى IFS ، و GM 048071 و GM 065830 إلى IP.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
خلايا
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الورم الأرومي العصبي البشري SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | |
| Cal-520 / AM | AAT Bioquest Inc. | 21130 | |
| ci-IP3 < / sub> (D-23-O< em>-Isopropylidene-6-O< / em>-(2-nitro-4،5-dimethoxy)benzyl-myo-inositol 1،4،5-trisphosphate-Hexakis (بروبيونوكسي ميثيل) Ester | SiChem | cag-iso-2-145-10 | |
| DMSO / 20٪ الجنبي F127 | Invitrogen | P-3000MP | |
| EGTA / AM | Invitrogen | E-1219 | |
| أطباق تصوير ذات قاع زجاجي مقاس 35 مم | MatTek | P35G-1.5-14-C |
المراجع
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. Calcium signaling in smooth muscle. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
