외과적 결장 종양 및 정상 조직에서 일차 인간 세포를 추출하기 위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 그런 다음 분리된 세포를 세포외 기질 단백질에 의해 기능화되고 형광 마이크로비드가 내장된 부드럽고 탄력 있는 기질(폴리아크릴아미드 하이드로겔)에서 배양합니다. 견인 세포 분석은 세포 수축 응력을 평가하기 위해 수행됩니다.
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방법 논문
수술 조직에서 기본 인간 대장 종양 세포의 분리 및 견인 세포 계측법 부드러운 탄성 기판에 직접 배양
이 논문에서
요약
초록
암 세포 접착 수용체 이루어지는 코디 계층 - 기계 화학적 시스템과 관련된 신호 전달 막 단백질, 세포 골격 구조, 분자 모터 (1, 2)을 사용하여 복잡한 방식으로 기계적 강성 매트릭스 응답. Mechanosensitivity를 다른 암세포의 시험관에 하지 일차 인간 암 세포 불멸화 세포주 또는 일차 세포를 쥐 유래, 주로 연구 하였다. 따라서, 작은 시험관 일차 인간 대장 암 세포의 mechanosensitivity 대해 공지되어있다. 여기서, 최적화 프로토콜은 건강한 인간 암 수술 조직 샘플로부터 일차 인간 결장 세포의 분리를 설명하는 현상된다. 고립 대장 세포를 피브로넥틴 (세포 외 기질에 의해 기능화 기판 폴리 아크릴 아마이드 하이드로 겔과 강성 폴리스티렌 (~ 3.6 GPa의 강성) (10 kPa의 강성) (2 kPa의 강성) 부드럽고 뻣뻣한에 성공적으로 배양이 경우에). 형광 마이크로 비드를 세포 배양 표면 근방 소프트 겔에 포함되고, 정지 마찰 분석법 자유로운 개방형 액세스 소프트웨어를 이용하여 세포 수축 응력을 평가하기 위해 수행된다. 또한, 다른 강성 기판상의 면역 형광 현미경 검사는 기판의 강성의 함수로서 초점 유착을 함유하는 일차 전지의 형태, 세포 골격 조직 및 vinculin에 대한 유용한 정보를 제공한다.
서론
기계적인 미세 환경은, 생화학 적 요인 외에, 세포 기능을 조절하는데 중요한 역할을한다는 것이 최근 점점 분명하게되었다. 세포를 감지하고이 3-7 (2D 배양에서와 같이)에 부착 또는 (3D 배양에서와 같이)에 의해 포위되어있는 기판의 강성에 응답 할 수있다. 이렇게함으로써, 세포 분화 3, 4 형태, 이주 / 운동성 5 바이오 물성 (6), (7)의 성장 및 기타 프로세스를 변조 할 수있다.
암세포는 또한 접착 수용체의 조정, 계층 - 기계 화학적 결합과 관련된 신호 전달 막 단백질, 세포 골격 구조, 분자 모터 (1, 2)을 사용하여 2 차원 및 3 차원 매트릭스 강성 응답한다. 예를 들어, 유선 상피 세포 (MEC의) 150 아빠 기판에 배양 할 때 강성과 유사 정상적인 선포 실질을 형성건강한 유방 조직. 흥미롭게도, 이들은 종양 기질 (8)의 강성을 모방 딱딱한 기판 (> 5,000 PA)에서 배양 구조와 전사 모두 현상 종양의 특징은 나타낸다. 또 다른 실험은 유방 종양 콜라겐 가교 ECM 9 보강 동반되는 것을 나타낸다. 최근의 실험들은 생리적으로 중요한 강성 (20-47 kPa의)을 갖는 2....
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프로토콜
아래에서 설명하는 프로토콜은 UIUC 인간 연구 윤리위원회의 지침을 따른다.
1. 수집 및 수술 조직 샘플의 소화
- 우측 결장 절제술 (도 1a 및도 1b) 후 종양 조직 샘플을 수집. 뿐만 아니라 인접한 건강한 사이트에서 조직을 수집합니다.
- 12 ㎖의 HBSS를 함유하는 용액 15 ml의 유리 병에 즉시 조직을 옮긴다. 절연 거품 상자 안에 얼음에 병을 보관하십시오.
- 45 분 내에서 추가 처리를 위해 조직 배양 후드로 조직 함유 바이알 전송. 후드 안쪽에 얼음 블록에 병을 보관하십시오.
- 피펫을 사용하여 HBSS 용액을 6-7 ml의를 포함하는 6 웰 플레이트에 공급 조직을 따르십시오.
참고 : 물론 당 조직의 양이 헹굼 단계에서 중요하지 않습니다. - 얼음 블록에 6 웰 플레이트를 유지합니다. 두번 HBSS 용액 조직을 씻어.
- 멸균 SCIS와 분리 된 섹션으로 깔끔하게 조직을 잘라SOR. 작은 부분으로 말하다 조직 멸균 메스 블레이드와 크기가 1-2mm 3보다 크지.
- 조직을 전송하기 전에 (0.1 % 트립신 용액 1㎖를 함유) 표지 된 0.1 % 트립신 바이알을 단다. 피펫으로 0.1 % 트립....
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결과
위에서 설명한 프로토콜은 성공적으로 기관 검토위원회의 지침에 따라 네 가지 환자에서 여러 조직 샘플 (N = 12)을 위해 사용된다. 그림 1A 바로 세포 배양에 대한 조직 섹션이 얻을 수있는 수술 후 대표적인 대장 종양을 보여줍니다. 추가 처리를 위해 층류 후드 전사 후 HBSS 용액 전형적인 조직 절편은도 1b에 도시되어있다. 소화 및 단일 세포 현탁액으로 수술 조직 샘플의 효소 분해의 개략도는도 2에 도시되어있다.
성공적인 조직 분리 한 후, 고립 된 차 인간의 세포는 PA 젤 폴리스티렌 요리에 씨앗을 품고있다. 위상차 현미경 사진 (도 3A 및 3B)는, 기판의 강성의 함수로 일차 인간 대장 암과 정상 세포의 대표적인 형태를 나타낸다. 이는 분명하다(건강과 암 모두) 주 결장 세포는 PA 젤 (그림 3a<.......
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토론
셀룰러 견인 스트레스는 최근 전이 상태 (13)의 잠재적 인 생물 물리학 적 지표로 떠오르고있다. 그러나 차 종양 세포와의 실험 견인 데이터는 현재까지 문헌에 존재하지 않습니다. 또한, 다른 강성 폴리 아크릴 아마이드 젤에 직접 배양 고립 된 차 대장 세포는 아직보고되지 않습니다. 따라서, 우리는 겔 및 폴리스티렌 (도 2)에 최적화 된 일차 결장 세포 배양 조건을 확립한다. 소프트 겔 제조시 세포 배양 표면 근방 형광 마이크로 비드 캡슐화 변위 필드 및 일차 인간 세포 (도 4C, 4D 및 4E)에 의해 생성 된 마찰의 측정을 가능하게한다. 또한, 면역 형광 분석은 세포 골격 조직 및 기판 강성도 변화와 같은 국소 유착 (- 5D도 5a)에 관한 중요한 정보를 제공 할 수있다. 그 다른 암과 정상 불후의 세포를 참고라인도 확산, 굴지의 스트레스 번들 형성을 증강 증가 기판 강성
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 프로젝트는 National Science Foundation ECCS 보조금 10-02165 및 Interdisciplinary Innovation Initiative Program, University of Illinois 보조금 12035의 지원을 받았습니다. M.Y. A.는 UIUC에서 NIH National Cancer Institute Alliance for Nanotechnology in Cancer 'Midwest Cancer Nanotechnology Training Center' 보조금 R25 CA154015A의 지원을 받았습니다. 이누노염색(Immnunostaining) 및 컨포칼 현미경 이미징은 UIUC의 IGB(Institute for Genomic Biology)에서 수행되었습니다. M.Y.A.는 격리 실험에 관해 UIUC의 B. J. Williams와 논의한 것을 인정한다. M.Y.A.는 회로도 및 재료 목록 준비에 도움을 준 UIUC의 C. Nemeh와 Abdul Bhuiya에게 감사를 표합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| HBSS | Life technologies | 14175-095 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Trypsin | Worthington | LS003736 | |
| Collagenese | Worthington | LS004176 | |
| 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) | 시그마-알드리치 | 281778 | |
| 글루타르알데히드 | Polysciences, Inc. | 01201-5 | |
| 아크릴아미드 | 시그마-알드리치 | A4058 | |
| N-메틸렌비스아크릴아미드 (비스) | 시그마-알드리치 | M1533 | |
| HEPES 완충 용액 | 시그마-알드리치 | 83264 | |
| 과황산암모늄 | 바이오-라드 | 161-0700 | |
| 인간 피브로넥틴 | BD 생명과학 | 354008 | |
| 히드라진 수화물 | Sigma-Aldrich | 18412 | 위험한 |
| 아세트산 | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| 파라포름알데히드 | 전자 현미경 과학 | RT15710 | |
| 신호 강화제 | 생명 과학 | I36933 | |
| 단클론 항 빈쿨린 항체 | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Alexa Fluor 488 염소 안티-마우스 IgG | Life technologies | A11001 | |
| TRITC phalloidin conjugates | 시그마-알드리치 | P1951 | |
| 0.1 &마이크로; m 형광 비드 | Life technologies | F8801 | |
| 0.25% 트립신-EDTA | 라이프 테크놀로지 | 25200-056 | |
| Materials | |||
| 12 mm2 glass 커버 슬립 | Corning | 2865-12 |
참고문헌
- Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
- Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer Metastasis Rev. 28
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재인쇄 및 허가
