باستخدام الإسفار خلية المنشط الفرز لفحص الخلية من نوع محدد التعبير الجيني في الأنسجة دماغ الفئران

ملخص

الهدف من هذا البروتوكول هو استخدام تقنية فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) لفرز أنواع معينة من الخلايا العصبية للتحليل اللاحق للتعبير الجيني الخاص بنوع الخلية ، وعلامات الوراثة اللاجينية ، و / أو التعبير عن البروتين.

الملخص

يتكون الدماغ من أربعة أنواع الخلايا الأولية بما في ذلك الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، الخلايا الدبقية الصغيرة و oligodendrocytes. على الرغم من أنها ليست هي نوع من الخلايا الأكثر وفرة في الدماغ، الخلايا العصبية هي درس على نطاق واسع من هذين النوعين من الخلايا نظرا لدورها المباشر في التأثير على السلوكيات. أنواع الخلايا الأخرى في الدماغ تؤثر أيضا على وظيفة الخلايا العصبية والسلوك عبر الجزيئات يشير التي تنتجها. يجب أن علماء الأعصاب على فهم التفاعلات بين أنواع الخلايا في الدماغ لفهم أفضل لكيفية هذه التفاعلات تؤثر وظيفة العصبية والأمراض. حتى الآن، والأسلوب الأكثر شيوعا لتحليل البروتين أو التعبير الجيني يستخدم تجانس عينات الأنسجة كلها، وعادة مع الدم، ودون مراعاة لنوع من الخلايا. هذا النهج هو نهج إعلامي لدراسة التغيرات العامة في الجين أو البروتين التعبير التي قد تؤثر على وظيفة العصبية والسلوك. ومع ذلك، فإن هذا الأسلوب من التحليل لا تصلح لفهم أكبر من الخلايامن نوع محددة التعبير الجيني وتأثير الاتصالات خلية إلى خلية على وظيفة العصبية. وقد تم تحليل علم التخلق السلوكية مساحة التركيز المتزايد الذي يدرس كيفية إدخال تعديلات على الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA) تأثير بنية التعبير الجيني على المدى الطويل والسلوك. ومع ذلك، قد تكون هذه المعلومات ذات صلة بالموضوع إلا إذا حللت بطريقة خلية من نوع معين بالنظر إلى النسب التفاضلية وبالتالي علامات جينية التي قد تكون موجودة في جينات معينة من أنواع الخلايا العصبية الفردية. خلية الإسفار المنشط الفرز (FACS) تقنية الموضحة أدناه يوفر وسيلة بسيطة وفعالة لعزل الخلايا العصبية الفردية للتحليل لاحقة في التعبير الجيني، والبروتين التعبير، أو تعديلات جينية من الحمض النووي. ويمكن أيضا أن يتم تعديل هذه التقنية لعزل أكثر أنواع محددة الخلية العصبية في الدماغ لتحليلها خلية من نوع معين لاحق.

المقدمة

الغرض من البروتوكول الموضح أدناه هو عزل أنواع الخلايا الفردية عن مجموعة غير متجانسة من الأنسجة العصبية للتحليل اللاحق للتعبير الجيني الخاص بنوع الخلية أو التعبير البروتيني أو حتى العلامات اللاجينية يتكون الدماغ من العديد من أنواع الخلايا المشتقة من خلايا سلفية مميزة والتي لها خصائص ووظائف خاصة بنوع الخلية. على الرغم من هذه الاختلافات ، يمكن لأنواع الخلايا العصبية المتميزة هذه التعبير عن مستقبلات وجزيئات إشارات داخل الخلايا متشابهة مما يجعل من الصعب قياس تحليل هذه البروتينات في كل مكان أو تفسيرها بطريقة خاصة بنوع الخلية باستخدام الطرق التقليدية. يجب على علماء الأعصاب تحديد وظيفة وتنشيط هذه الأنواع المتميزة من الخلايا في الدماغ وكيف يمكن أن تؤثر بشكل فردي على السلوك ل....

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. التحضير لجمع الأنسجة (15 - 30 دقيقة)

1. تلميع الحرائق ثلاث مجموعات من ماصات باستور الزجاجية بأقطار متناقصة وترقيمها "1" = قطرها حوالي 1 مم ، و "2" = قطرها حوالي 0.75 مم ، و "3" = قطرها حوالي 0.50 مم.
2. أعد تعليق الإنزيم A المجفف بالتجميد مع كل المخزن المؤقت A وفقا للبروتوكول المقدم مع مجموعة التفكك العصبي (انظر جدول المواد). لا تدوام. اقتبس المحلول في 50 ميكرولتر وقم بتخزينه في -20 درجة مئوية لاستخدامه لاحقا.
3. اصنع 1 لتر من المخزن المؤقت لإزالة المايلين وفلتر الفراغ للتعقيم [المخزن المؤقت لإزالة المايلين = 1,000 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 0.1 M (PBS) ، 2 مل من 500 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) ، و 10 جم من ألبو....

النتائج

أهمية استنفاد الميالين وتروية الأنسجة

يوضح الشكل 1 أهمية استنفاد الميالين. يحدث استنفاد الميالين (الخطوات من 5.1 إلى 5.12 من البروتوكول أعلاه) عندما يتم تحضين معلق الخلايا المفردة في خرزات إزالة الميالين، ثم غسله، وتمريره لاحقاً عبر العمود في جهاز الفرز المغناطيسي. الغرض من هذه الخطوات هو تقليل كمية الحطام الخلوي الموجود في كل عينة. فعند تفكيك العصبونات وسحقها، يمكن أن تنفصل الاستطالات التي تكون عادةً مغطاة بالميالين، وبالتالي قد تعطي صبغة إيجابية مع جسم المضاد Thy1. وينتج عن .......

المناقشة

على غرار العديد من الأنسجة والأنظمة الأخرى ، يتكون الدماغ من مجموعة خلايا غير متجانسة تعمل معا للتأثير على السلوك. إن تحليل التعبير الجيني أو تعبير البروتين أو التعديلات اللاجينية من الخلايا الفردية داخل تلك المجموعة غير المتجانسة لديه القدرة على الكشف عن معلومات حول وظيفة النظام ككل ، وتحديد العمليات الخلوية التي تنظم كل من السلوك الطبيعي وعمليات المرض ، وتوفير أهداف خاصة بنوع الخلية للعلاجات المحتملة. من الممكن في المستقبل أن يؤدي تعديل وظيفة نوع خلية واحدة داخل الدماغ إلى فتح مفتاح علاج الاضطرابات التنكسية العصبية أو .......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
طقم التفكك العصبي (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628
حبات إزالة المايلين II	Miltenyi Biotec	130-096-733
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
فاصل QuadroMACS	Miltenyi Biotec	130-090-976
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
ورقة شبكة النايلون	أمازون	CMN-0074-10YD	40 بوصة العرض ، 80 ميكرون حجم شبكة
Fc Block / anti-CD32	BD Biosciences	BDB550270	التفاعل للفئران
CD11b المترافق مع APC		201809	التفاعل للفئران
الأرنب المضاد ل GLT1	Novus Biologicals	NBP1-20136	التفاعل للفئران أو الإنسان
المترافق PE مضاد للأرانب الجسم المضاد الثانوي	eBioscience	1037259	الجسم المضاد الثانوي للجسم
المضاد للفأر المضاد للفئران CD90 (Thy1) المضاد ل GLT1 FITC CD90 (Thy1)	Biolegend	202504	للفئران

Biolegend تفاعل