이 원고는 임신 중 자궁 내 압력을 측정하기 위해 마우스에 텔레미터를 이식하는 프로토콜을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
분자 및 전기 신호의 복잡한 통합 임신의 단부에 수축 기관에 무부하 자궁 변환하는데 필요하다. 자궁 수축의 핵심 규제의 발견에도 불구하고,이 과정은 아직 완전히 이해되지 않습니다. 형질 전환 마우스는 출산을 연구하기에 이상적인 모델을 제공합니다. 이전에는 마우스의 자궁 수축을 연구 할 수있는 유일한 방법은 여러 가지 이유로 최적입니다 생체 아이소 메트릭 장력 기록했다. 자궁이 생리 학적 환경에서 제거해야합니다, 조사의 제한된 시간 코스가 가능하며, 마우스를 희생해야합니다. 방사성 원격 측정 최근 개발은 마우스에서 생체 내 자궁 내 압력의 길이, 실시간 측정을 허용했다. 배달 설명 될 때까지 여기, 자궁 텔레의 주입은 임신 중기에서 마우스 자궁의 압력 변화를 측정합니다. 언론의 비교 차이로야생형 및 트랜스 제닉 마우스는 간을 실시해, 관심 유전자의 생리적 영향이 설명 될 수있다. 이 기술은 조산을 포함한 임신 중 자궁 근 장애를 치료하는 데 사용되는 치료제의 개발을 촉진한다.
서론
조산은 주 산기 이환율과 선진국에서 사망의 주요 원인이다 그것은 주 산기 사망률의 50 % 및 주 산기 사망률 1, 2의 75 %에 대한 책임이 있습니다. 조기 진통은 다각적이고 특발성 수 있습니다. 많은 연구가 수축 하나에 대기 조직의 근육층을 변환 분자 및 전기 경로에 등장했지만, 조산의 정확한 병태 생리는 애매 남아있다. 내분비, 염증, 및 유전자 조절은 모든 조산 3,4에 연결되어있다. 그러나 윤리적 인 문제는 인간의 조산의 메커니즘에 대한 연구를 수행하는 능력을 제한한다.
이러한 한계를 감안할 때, 많은 연구자들은 분만의 생리를 연구하는과 모델 시스템으로 마우스에 설정되어있다. 마우스는 짧은 임신 기간은 약 3 주 지속하고 쉽게 유 전적으로 조작 할 수있다. 또한, 다수의 유전자 마우스 모델은 할노동 5에 필수적인 신호 전달 경로를 결정하기 위해 개발되었다. 마우스와 인간의 출산 사이의 키 차이에도 불구하고, 마우스와 인간은 자궁 내 염증과 감염 (6)를 포함하여 노동에 필수적인 같은 메커니즘의 많은 것을 공유 할 수 있습니다. 따라서, 마우스는 자궁의 활동을 조사하기위한 매우 중요한 도구 역할을한다. 현재까지, 황금 표준이 생쥐의 자궁 수축력을 측정하는 것은 생체 아이소 메트릭 장력 기록하고있다; 그러나, 이것은 실험 당 하나 임신성 시점 제한되며 생리적 환경에서 자궁을 제거를 필요로한다. 또 다른 중요한 요소는이 조사에 필요한 동물의 다수이다. 마지막으로,이 방법은 노동과 조기 병태 생리의 유도를 검토 종 연구를 허용하지 않습니다.
동맥 압력을 연구하는 데 사용 방사성 동위 원소 원격 측정 장치에 대한 최근의 발전 마우스와 INT 7 변경쥐 8 rauterine 압력이 같은 기술은 임신 중에 생쥐의 자궁 내 압력의 변화를 연구하는 데 사용할 수 있는지 여부에 대한 질문을 구걸했다. 초기 문제 후, 방법은 성공적 마우스에서 유도 분만과 진행을 측정하기 위해 개발되었다. 이 방법은 생체 내 강제 노동 수축 나타내는 고압 상태로 무부하 자궁 저압 상태로부터 천이를 측정 할 수있다. 이 방법은 유전자 발현 (9)의 생리적 영향을 보여주는 손상 분만 및 야생형 마우스와 트랜스 제닉 마우스 사이에 상당한 압력 차이를 감지 할 수있다. 이 프로토콜은 임신 중에 마우스 자궁 압력을 연구하는 생체 방법, 실시간을 제공합니다.
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프로토콜
참고 : 국립 보건원 (National Institutes of Health)에서 정한 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드 라인을 준수 모든 동물 절차. 모든 프로토콜은 세인트 루이스에있는 워싱턴 대학의 동물 연구위원회에 의해 승인되었다.
참고 :이 프로토콜에 대한 특정 재료 및 장비 재료 및 장비 테이블을 나열되어 있습니다.
여성 마우스의 1 시간 초과 사육
- 남성과 2 시간의 시간 창에서 연령이 6 개월 사이의 성인 여성 새끼를 낳. 그들은 실험의 전체에 대한 일관성 유지와 같은 특정 번식 시간이 긴으로 필요하지 않습니다.
- copulatory 플러그의 존재에 의해 임신을 확인합니다. 플러그가 처음 일 후 성교 0 (dpc0)으로 간주되는 날짜와 시간을 지정합니다. 압력 녹음을 시작할 때 특정 시간을 기억하십시오.
- dpc8-13에 수술을 수행합니다. 정확한 DPC는 마우스 변형에 따라 달라집니다.
- 마우스는 수술, 체육 전에 임신 여부를 결정하려면마취 전 투여 촬상 시스템에 결합 40MHz의 선형 어레이 프로브 rform 복부 초음파 촬상. 이것은 임신 낭의 시각화 수 있습니다. 초음파 시스템을 사용할 수없는 경우, 마우스의 체중을 사용한다.
주 : dpc0 및 dpc8 및 복부 팽만 사이에 적어도 2g의 체중 증가는 임신의 좋은 지표이다.
2. 텔레 메 트리 수술 준비
- 수술 전 24 시간 내에 악기, 거즈, 면봉, 수술 커튼, 피펫 팁을 살균 오토 클레이브를 사용합니다.
- 70 % 에탄올로 청소 수술 표면.
- (설치류에 대한 전문) 가열 패드와 비드 살균기를 켭니다.
3. 텔레 메 트리 수술
- 마취, 1-2 L / 분의 산소 유속 4 내지 5 %의 이소 플루 란을 사용한다.
- 마우스가 마취의 징후가 표시 될 때까지 기다린 다음 부 프레 노르 핀과 피하 주사 (진통제 : 20g 당 0.1 ㎖).
- 방광 아래 갈비뼈의 바닥에서 마우스의 복부를 면도.
- 예열 가열 패드에 수술 테이블에 마우스를 가져, 건조를 방지하기 위해 안과 연고와 마우스의 눈을 커버합니다.
- 멸균 기술을 시작합니다. 멸균 장갑에 넣고 요오드 에탄올 스크럽을 배치하는 멸균 표면으로 래퍼를 유지합니다.
- 패키지 또는 식염수에서 측거기를 제거하고 멸균 거즈에 배치 멸균 집게를 사용합니다.
- 젤 카테터 팁을 채우기 위해 (텔레 공급 업체에서 제공) 주사기를 사용합니다. 부드럽게 카테터에 젤을 그릴 수있는 충분한 음압을 만들어 카테터를 짠다.
- 피펫에 멸균 팁을 놓습니다. 피펫이 수술 접착제의 μL 및 멸균 표면에 피펫을 설정합니다.
- 요오드 다음 70 % 에탄올로 영역을 채취, 수술 부위를 청소합니다.
- 만큼 충분히 큰 수술 드레이프에 구멍을 잘라마우스를 통해 절개와 장소에 필요한 지역.
- 마우스가 완전히 절개를하기 전에 마취 보장하기 위해 발 핀치 (페달 응답)를 수행합니다.
- 작은 수직 정중선 절개를합니다. 다음으로, 기본 신체 벽 근육을 통해 비슷한 절개를합니다.
- 부드럽게 체강에서 자궁을 당겨 가능한있는 대부분의 새끼를 포함하는 자궁 경적을 찾습니다.
- - 선택의 miRNA의 덧셈, 텔레 삽입하기 전에 자궁의 근육층에 바이러스 벡터를 주입.
- 3mm 에지 스프링 절단 가위로 자궁 뿔의 끝 부분에 작은 절개를합니다.
- 자궁 벽과 태아 낭 사이에, 압박하지 않고, 카테터를 스레드. 그 실수로 제거를 줄이기 위해 여러 주머니 과거 카테터를 삽입합니다. 태아 주머니가 삽입에 의해 방해되지 않았는지 확인합니다.
- U에 카테터를 준수하기 위해 텔레 삽입의 사이트에 수술 접착제를 피펫terine 혼은 자궁 뿔에서 미끄러지는 카테터를 방지합니다. 경직되기 위해 접착제 몇 초를 기다린 후 조심스럽게 체강 내부의 자궁을 다시 배치합니다.
- 카테터 삽입 부위의 반대측에, 체강 내의 텔레 배치.
- 6.0 흡수성 봉합 체강 봉합사. 첫째, 지갑 스티치 후 3-4 개별 바늘을한다.
- 동일한 기술을 이용하여 피부를 봉합사하지만 6-0 비 흡수성 봉합사.
- 면봉 디부 카인 (국소 진통제) 절개 사이트를 통해 연고.
- 동물을 재수하기 위해 멸균 생리 식염수를 피하의 0.3-0.4 ml를 주입한다.
- 완전히 깨어 때까지 수술 후 동물을 모니터링합니다. 자유롭게으로 침구의 특정 유형 심하게 마취 마우스를 질식 수있는 테이블 위의 머리를 보유 할 수있을 때까지 다시 케이지에 마우스를 올려 놓지 마십시오. 30 ~ 45 분 동안 마취 된 마우스의 경우, 하나는 제 기대한다전자 마우스는 1 시간 15 분으로 완전히 깨어합니다.
- 추가 수술을 수행하는 경우, 70 % 에탄올과 구슬은 다시 사용하기 전에 소독으로 악기를 닦으십시오.
4. 수술 후 복구
- 로그에 매일 수술 후 진행 상황을 모니터링합니다. 체중 증가 및 손실 카탈로그 및 혼수, 출혈, 또는 외과 적 절개의 완전 폐쇄를 감시.
- 마우스 부드럽게 마우스 우 (~ 사과의 일관성) 또는 전문 복구 다이어트 식품을 공급.
- 봉합을 검사하여 인출하지 있는지 확인하지만, 과도하게 마우스를 처리하지 않도록 노력하라.
5. 원격 측정 기록
- (마우스가 수술에서 회복 적어도 2-3일 후) 관심의 날, 텔레 켜 마우스 근처에 자석을 배치합니다. 수신기에 마우스 케이지를 넣습니다. 텔레이 활성화 된 경우 수신기의 표시등이 켜져 야합니다.
- 새로운 teleme 교정 제조업체 특정 교정과 TERS를 제공합니다. 재사용 된 원격 계측기 교정 사양은 소프트웨어에 보관됩니다.
- 소프트웨어 내에서, "동물"을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 녹음을 시작하고 "시작 샘플링, 연속,"최대 500 Hz에서의 속도로 샘플링을 할 수 있습니다 클릭합니다. 소프트웨어를 저장하고 추적하도록 설정되어 있는지 확인합니다.
참고 : 샘플링 마우스 아이콘이 녹색으로 바뀌면, 압력이 기록되고있다. 운반 중에 마우스를 방해하는 방해하거나 노동을 변경, 그래서 조심스럽게 관찰 할 수 있습니다. - 관심의 인도 또는 시간 기간이 지난 후에, "동물"에 마우스 오른쪽 버튼을 클릭 기록과 "모든 녹음을 중지"를 선택 중지합니다. 텔레 배터리는 일반적으로 만 연속 기록의 1.5 개월 동안 지속됩니다로서, 배터리 사용 시간을 절약하기 위해 텔레을 해제 자석을 사용합니다.
- CO 2 과다 복용으로 마우스를 안락사와 텔레을 복구 할 수 있습니다. 새끼는 잘린 안락사된다.
- 실온에서 밤새도록 탈 이온수에 1 %의 효소 세제에서 텔레 배치.
- 탈 이온수 측거기를 씻어 카테터를 짜내 않도록주의하면서, 모든 조직 및 접착제를 제거합니다.
- 소독 실온에서 24 시간 동안 2 % 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde)의 텔레을 품어.
- 멸균 식염수 측거기를 헹군 다음 주입까지 멸균 식염수에 보관하거나 개조하는 제조업 자에게 다시 되돌려 보낼 수. 조직이 멸균 카테터의 내부에있는 경우 Telemeters 단장해야한다. 일반적으로 telemeters 단장 할 필요가 전에 4-5 번 사용할 수 있습니다.
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결과
생체 내 자궁 내 압력 실시간 원격 측정은 수집 시스템을 이용하여 기록 될 수있다. 마우스의 동시 녹화와 짝 압력 샘플링 각 강아지의 전달의 정확한 시간을 캡처 어머니의 자궁 내 압력 배달 시간 상관 관계를 사용 하였다. 모든 데이터 포인트는 압력 - 대 - 시간 곡선 (도 1A)을 생성하는 플롯에 걸쳐 기록 될 수있다. 이 플롯은 임신 중에 점을 나타낸다 때 자궁 내 압력 변화뿐만 아니라 명암주기 사이의 압력 차. 또한, 자궁 내 압력의 이동 평균 (도 1b) 플롯 될 수있다. 이것은 (배달 동안 획득 기록은 이전에 9 게시 된) 더 쉽게 노동 과정과 관련된 수축 자궁 내 압력 특성의 지속적인 증가를 시각화하는 데 유용합니다.
데이터는 추가로 분석 소프트웨어에 데이터 포인트를 내보내고 관심 기간 동안 데이터를 평균화함으로써 분석 될 수있다. 일일 트랜스 제닉 마우스...
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토론
자궁 근 수축의 조사는 근육 긴장의 생체 측정에 의존하고있다. 이 방법론은 동물을 살 관리 할 수 없습니다 새로 개발 된 uterotonic 약물의 초기 단계의 테스트를 위해 유용 할 수 있습니다. 길이 방향의 진행 노동을 이해하지만, 생체 내 접근법이 필요하다. 생체 측정은 여러 가지 용도로 사용. 첫째, 임신 기간 동안 자궁 수축 패턴의 변화의 완전한 그림의 캡처를 할 수 있습니다. 둘째, 자궁 조직을 필요로 생체 레코딩 바이어스 자궁의 순환 및 세로 근육층의 완전한 역할에 대한 이해를 제한, 세로 또는 가로로 장착되도록 제거한다. 셋째, 따라서 그들은 가능 더 정확하게 마우스 모델에서 분만 공부 만드는 내인성 호르몬 환경에서 자궁의 압력 기록을 허용한다. 마지막으로, 그들은 더 TR 허용자궁 원격으로 마우스 모델과 인간 사이의 anslational 조사는 더 밀접하게 자궁 내 압력 카테터를 임신 한 여성에서 촬영 측정을 닮았다.
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 March of Dimes FY12-133 (S.K.E.) 및 National Institutes of Health R01HD037831 (S.K.E.)의 자금 지원을 받았습니다. 원고에 대한 비판적 검토를 해주신 Deborah Frank 박사님께 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 외과 용 접착제 | 3M Vetbond | 1469SB | 조직 접착제 - Drierite에 저장 |
| 흡수성 6-0 봉합사 | Ethicon | J212H | Vicryl |
| Non-absorbable 6-0 Sutures | Ethicon | 8706H | Prolene |
| Water Jacket 담요 + 난방 패드 | Gaymer | T / Pump PN 11184-000 담요 -66N111CC | 설치류 전문 |
| 비드 살균기 | Keller | Z378577 | Steri 250 살균기 |
| 해부 현미경 | Nikon | SMZ754 | 광섬유 거위목 외부 광원 |
| 멸균 수술용 장갑--라텍스 | Cardinal Health Triflex | 2D7253 | |
| PhysioTel PA-C10 압력 송신기 | Data Sciences International | 270-0135-001 | TA11PA-C10 |
| 텔레미터 수신기 | Data Sciences International | 272-6001-001 | RPC-1 |
| Dataquest ART 4.3.2 분석 플래티넘 | Data Sciences International | 271-0147-141 | 분석 소프트웨어 |
| 다이어트 회복 젤 | 클리어 H2O | 72-01-5022 | 설치류용 정제 소프트 다이어트 |
| Tergazyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | 효소 세제 |
참고문헌
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