Qui viene descritto un metodo che consente una preparazione rapida, efficiente ed economica di gel di poliacrilammide in un formato di piastra multipozzetto. Il metodo non richiede alcuna attrezzatura specializzata e potrebbe essere facilmente adottato da qualsiasi laboratorio di ricerca. Sarebbe particolarmente utile nella ricerca incentrata sulla comprensione delle risposte cellulari dipendenti dalla rigidità.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Semplice Poliacrilammide-based a più pozzetti Rigidità Assay per lo Studio della rigidezza-dipendenti le risposte delle cellule
In questo articolo
Sommario
Abstract
Attualmente, la maggior parte della ricerca cellulare in vitro viene eseguita su polistirene di coltura di tessuti rigidi (~1 GPa), mentre la maggior parte delle cellule del corpo sono attaccate a una matrice elastica e molto più morbida (0,1 – 100 kPa). Poiché tale discrepanza di rigidità influisce notevolmente sulle risposte cellulari, vi è un forte interesse nello sviluppo di materiali idrogel che si estendono su un'ampia gamma di rigidità per fungere da substrati cellulari. I gel di poliacrilammide, che sono economici e coprono l'intervallo di rigidità di tutti i tessuti molli del corpo, sono l'idrogel di scelta per molti gruppi di ricerca. Tuttavia, la preparazione del gel di poliacrilammide è lunga, noiosa e adatta solo per piccoli lotti. Qui, descriviamo un test che, utilizzando un film plastico flessibile permanente come supporto strutturale per i gel, consente la preparazione di gel di poliacrilammide in un formato di piastra multipozzetto. La tecnica è più veloce, più efficiente e meno costosa rispetto ai metodi attuali e consente la preparazione di gel di dimensioni personalizzate non altrimenti disponibili. Poiché non richiede alcuna attrezzatura specializzata, il metodo potrebbe essere facilmente adottato da qualsiasi laboratorio di ricerca e sarebbe particolarmente utile nella ricerca incentrata sulla comprensione delle risposte cellulari dipendenti dalla rigidità.
Introduzione
La maggior parte dei tessuti del corpo sono materiali viscoelastici morbidi con un modulo di Young che vanno da 0,1 kPa per cervello a 100 kPa per cartilagine morbida, ma, più in ricerca sulle cellule vitro è condotta su coltura tissutale polistirene (TCP), che ha un modulo di ~ 1 GPa . 1 Questa mancata corrispondenza rigidità influenza notevolmente il modo in cui le cellule rispondono al loro ambiente. Un crescente corpo di ricerca è quindi dedicata alla chiarire l'effetto del substrato rigidità sul destino di vari tipi cellulari, comprese le cellule staminali 2,3. 4 Come risultato, più idrogel sono stati sviluppati per ai....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Preparazione di soluzioni e Aliquote Hydrogel associati
- Preparazione della soluzione poliacrilammide gel precursore.
- Preparare soluzione di gel di poliacrilammide precursore miscelando acrilammide (A) (40% w / v, M r 71.08 g / mol), la bisacrylamide reticolante (B) (2% w / v, M r 154.17 g / mol), e de- acqua ionizzata nelle percentuali di volume specificati nella tabella 1.
NOTA: Queste soluzioni possono essere preparati in grandi lotti e conservati a 4 ° C fino a diversi mesi.- ATTENZIONE: L'acrilamide è tossica su inalazione o ingestione, in particolare, se in polvere: così, utilizzare....
- Preparare soluzione di gel di poliacrilammide precursore miscelando acrilammide (A) (40% w / v, M r 71.08 g / mol), la bisacrylamide reticolante (B) (2% w / v, M r 154.17 g / mol), e de- acqua ionizzata nelle percentuali di volume specificati nella tabella 1.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Poliacrilammide (PA) idrogel sono ampiamente usati per testare le risposte delle cellule rigidità-dipendente. 17,24 Miscelando varie concentrazioni di acrilammide (A) e bis-acrilamide (B) si possono fare gel PA che abbracciano la gamma di maggior rigidità tessuti molli in il corpo - 0,3 -.. 300 modulo di kPa giovane 1 Tuttavia, la preparazione di gel di poliacrilammide è noioso e che richiede tempo, spesso limitando la loro utilità in applicazioni "high throughput" come per lo screening e.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Gel di poliacrilammide, originariamente sviluppati per elettroforesi, 28 sono oggi utilizzati di routine come substrati di coltura cellulare per studiare gli effetti di substrato rigidità sulla morfologia delle cellule, la motilità e la comunicazione 3,24,29 tra le altre caratteristiche cellulari. Poliacrilammide consente la manipolazione del substrato rigidità che comprende la rigidità di tutti i tessuti molli del corpo (0,3 - 300 kPa) 1 con una semplice variazione della concentrazione .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dai fondi iniziali forniti alla Dott.ssa Silviya Zustiak dall'Università di Saint Louis e da una sovvenzione del President's Research Fund (PRF) assegnata alla Dott.ssa Silviya Zustiak dall'Università di Saint Louis. Ringraziamo Naveed Ahmed e Keval Shah per l'assistenza tecnica.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| 40% Acrilammide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% Bis-acrilammide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Persolfato di ammonio | Bio-Rad | 161-07000 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Sulfo-SANPAH | Thermo Scientific | 22589 | |
| Collagene di tipo 1, da coda di ratto, 3,68 mg/ml | BD Biosciences | 354236 | |
| Dimetilsolfossido (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Soluzione idrofobica — Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
| Polidimeilsilossano (PDMS) [Kit elastomero Slygard 182] | Adesivi Elsworth | 3097358-1004 | |
| Tyrpsin/EDTA (10x) | Sigma Aldrich | 44174 | |
| RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| Siero fetale bovino | HyClone | SH30073-03 | |
| Penicillina Streptomicina | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Detergente: Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Soluzione di formaldeide al 37% | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| Kit di blocco dell'adesione cellulare basato su BSA — Kit array di adesione cellulare ECM | Chemicon International | ECM540 | |
| Attrezzatura da laboratorio monouso | |||
| flexible plastic support — GelBond PAG Film per gel di poliacrilammide | GE Healthcare Bio-Sciences | 309819 | |
| Piastre in vetro | Slumpys | GBS4100SFSL | |
| Provette coniche da 50 ml | Fisher | Scientific 3181345107 | |
| Provette coniche da 15 ml | FALCON | 352097 | |
| Provette per microcentrifuga | Fisher Scientific | 2 ml: 02681258 | |
| piastra da 96 pozzetti (fondo piatto) | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Pipette monouso (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml) | Fisher Scientific | 1 ml: 13-678-11B, 2 ml: 05214038, 5 ml (FALCON): 357529, 10 ml: 13-678-11E, 25 ml: 13-678-11, 50 ml: 13-678-11F | |
| Pipette di trasferimento in vetro | Fisher Scientific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| Puntali per pipette (1-200 μ l, 101-1000 μ l) | Fisher Scientific | 2707509 | |
| Pipette di trasferimento monouso standard in plastica | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
| Guanti da esplorazione senza polvere | Quest | 92897 | |
| Distanziatori in silicone — Foglio di silicone, 0,5 mm di spessore/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| Large/non-disposable lab equipment | |||
| Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| Forno UV | UVITRON | UV1080 | |
| Camera a vuoto/degasatore | BelArt | 999320237 | |
| Pompa a vuoto per degasatore | KNF Lab | 5097482 | |
| Cappa per coltura tissutale | NUAIRE | NU-425-600 | |
| Cappa per aspirazione chimica | KEWAUNEE | 99151 | |
| Microscopio invertito (Axiovert 25) | Incubatore | 663526 | |
| NUAIRE | NU-8500 | ||
| Pipetta Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| Ematocitometro | Bright-Line | 383684 |
Riferimenti
- Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3, 299-306 (2007).
- Minton, K. Mechanotransduction: A stiff response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (8), 500-500 (2014).
- Yeung,....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
Esplora altri articoli
Preparazione del gel di poliacrilammideFormato a piastra multipozzettoPreparazione del substrato di idrogelSupporto in plastica flessibileProcesso di polimerizzazione del gelApplicazione del rivestimento di collageneAnalisi della morfologia cellulareMisurazione del modulo di YoungTecniche di imaging microscopico
