כתב יד זה מתאר את השימוש בטכנולוגיה חדישה המסופקת על ידי מיקרו-מערכי DNA. מיקרו-מערכים מספקים סקירה כללית של השינויים הטרנסקריפטומיים בחיידקים שנגרמו בתנאי מסוים. יתר על כן, אנו מדגישים את הקלות שבה ניתן לנתח כמויות גדולות של נתונים באמצעות חבילות תוכנה נוחות שפותחו בבית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
צינור מהיר ואמין למחקר בקטריאלי transcriptome ניתוח מקרה: ויסות גני Serine תלויה ב
במאמר זה
סיכום
תקציר
ביטוי גנים והרגולציה שלה הם מאוד חשובים להבין את התנהגותם של תאים בתנאים שונים. טכניקות שונות משמשות כיום ללמוד ביטוי גנים, אך רובם מוגבלים במונחים של מתן תמונה כוללת של הביטוי לכל transcriptome. מערכי DNA מציעים טכנולוגית מחקר מהירה וכלכלית, אשר נותנת סקירה מלאה של ביטוי גנים הגלובלי ויש להם מספר עצום של יישומים, כולל זיהוי של גנים חדשים וגורם שעתוק מחייבים אתרים, אפיון של פעילות תעתיק של התאים וגם לעזור בניתוח אלפים של גנים (בניסוי יחיד). במחקר הנוכחי, את התנאים לניתוח transcriptome חיידקים מקציר תא לניתוח מערך DNA כבר מותאמים. אם ניקח בחשבון את הזמן, עלויות ודיוק של הניסויים, פלטפורמה טכנולוגית זו מוכיחה להיות שימושי מאוד ואוניברסלי applicabale ללימוד transcripto חיידקיםmes. כאן, אנו מבצעים ניתוח מערך DNA עם pneumoniae Streptococcus כמקרה מבחן-ידי השוואת תגובות תעתיק של ס ' pneumoniae גדל בנוכחות ריכוזים שונים L-סרין במדיום. RNA סה"כ היה מבודד באמצעות שיטת Macaloid באמצעות ערכת בידוד RNA והאיכות של RNA נבדק על ידי שימוש בערכת בדיקת איכות RNA. cDNA הוכן באמצעות transcriptase ההפוך ודגימות cDNA תויגו באמצעות אחת משני צבעי ניאון אמין-reactive. שקופיות מערך DNA תוצרת בית שמשו לכלאה של דגימות cDNA המסומנים ונתונים microarray נותחו באמצעות מסגרת עיבוד מראש נתונים microarray cDNA (Microprep). לבסוף, Cyber-T שימש כדי לנתח את הנתונים שנוצרו באמצעות Microprep לזיהוי גנים הביעו באופן דיפרנציאלי משמעותיים מבחינה סטטיסטית. חבילות תוכנה כמו כן, נבנו בבית (פלפל, FIVA, לחשוף, התובע, Genome2D) שמשו כדי לנתחנתונים.
מבוא
המחקר של המערך השלם של mRNA שפע (transcriptome) מקודד על ידי הגנום של האורגניזם חד-תאי או תא האיקריוטים בזמן מסוים או במצב מסוים, ובכלל זה ביטוי יתר של גן או נוק-אאוט, נקרא transcriptomics. Transcriptomics מאפשר לנו להתבונן למה גני המידה באים לידי ביטוי במצב מסוים בנקודת זמן X ונותן לנו מידע על כמה חזק גנים באים לידי ביטוי ביחס להתייחסות.
Microarray הוא מערך דו-ממדי על מצע מוצק (בדרך כלל שקופיות זכוכית או תא סרט דק סיליקון) שיכול לשמש לassay כמויות גדולות של חומר ביולוגי באמצעות הקרנת תפוקה גבוהה, וממוזער, עיבוד מרובב ומקביל וזיהוי שיטות. Microarrays בא בסוגים....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת מדיה, ותרבית תאים
- לגדול S. זן pneumoniae D39 wild-type 21 כפי שתואר לעיל 11. לחסן תאים מאוחסנים ב -80 o C בגליצרול 10% (עם יחס 1/100 בצינורות 50 מיליליטר סטרילי) ב 50 מיליליטר כימי מוגדר בינוני (CDM) עם pH סופי של 6.4 15, אבל להשמיט L-סרין מחומצת אמינו תערובת.
הערה: שני CDMS שונה שימש; אחד המכיל ריכוז מינימאלי של L-סרין (150 מיקרומטר) ואחר המכיל ריכוז מרבי של L-סרין (10 מ"מ). ריכוז מינימאלי זה בעצם הריכוז של L-סרין בפלזמת דם אדם והמטרה היא להשוות את ביטוי הגנים ש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
RNA, בידודי cDNA וניתוח
L-סרין הוא אחד מחומצות אמינו החיוניות וריכוזו בפלזמת דם אדם משתנה 60-150 מיקרומטר בילדים ומבוגרים. תפקידה בביוסינתזה של purines וpyrimidines מדגיש את חשיבותה בחילוף חומרים והוא מבשר על כמה חומצות אמינו (גליצין, ציסטאין וטריפטופן). כדי לחקור את ההשפעה של L-סרין על כל transcriptome של ס ' זן פראי סוג pneumoniae D39, ניתוח microarray של זן D39 גדל בCDM ע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אנו מתארים פרוטוקול ידידותי למשתמש שניתן ליישם כדי לבצע ניתוח transcriptome שלם של חיידקים. נקודת המפתח על הטכניקה המסוימת הזה היא שהמצב לפיו התאים נקצרים ישתנה. לאחר קצירת תאי הבידוד ו- RNA, טכניקה זו הופכת להיות שווה לכל סוגי דגימות חיידקים ופועלת בהתאם לשלבים זהים לחלוטין ולכן, יכולה להיות מיושמת על כל סוג של תרבות חיידקים. הפרוטוקול הוא מאוד פשוט ונוח ומתחיל מבידוד RNA. פרוטוקול בידוד RNA שלנו (באמצעות Macaloid וערכת בידוד RNA) הוא זמן יעיל בהשוואה לפנול, כלורופורם קונבנציונלי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
אנו מודים אן דה יונג וSiger Holsappel לעזרה עם הפקת שקופיות מערכי DNA. תמיכתה של אנה דה יונג לניתוח ביואינפורמטיקה גם מוערכת. אנו מודים גם Jelle Slager לבחינת הנייר. מוחמד אפזאל ואירפאן Manzoor נתמך על ידי אוניברסיטת GC, Faisalabad, פקיסטן במסגרת תכנית פיתוח סגל של HEC פקיסטן.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פנול חומצי | SigmaAldrich | P4682 | |
| ערכת בידוד RNA | רוש חרוזי | ||
| 105015 | |||
| IAA | 106630 | ||
| Nanodrop | Nanodrop | ND-100 | |
| Agilent BioAnalyser | Agilent | G2940CA | |
| Superscript III | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| AA-dUTP | Life technologies Invitrogen | AM8439 | |
| DDT | Life technologies Invitrogen | ||
| First Strand Buffer | Life Technologies Invitrogen | 18080044 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
| DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
| DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
| SHY Buffer | SigmaAldrich | H7033-125ML | |
| מצנן | Speedvac Eppendorf | RUGNE3140 | רכז Speedvac בתוספת |
| תנור היברידיזציה | Grant Boekel | Iso-20 | |
| Lifter-Slips | Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | |
| נגב KIMTECH | |||
| SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
| SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
| Genpix autoloader 4200A1 | MSD טכנולוגיות אנליטיות | סורק Microarray | |
| נתרן ביקרבונט | SigmaAldrich | 104766 |
מקורות
- Kayala, M. A., Baldi, P. Cyber-T web server: differential analysis of high-throughput data. Nucleic Acids Res. 40, W553-W559 (2012).
- Chang, T. W. Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface. J. Immunol. Methods.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
