Цель этого протокола заключается в изоляции лимфатические эндотелиальные клетки, выстилающие человека лимфатическая киста порок, как сосуды и крайнюю плоть с помощью сортировки флуоресценции активированных клеток (FACS). После культивирования и расширение этих клеток клеток позволяет новый уровень сложности для экспериментальной генетических, протеомных, функциональных и дифференцировки клеток исследований.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение человека эндотелиальных клеток лимфатической от нескольких параметров флуоресценции активирован сортировки клеток
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Лимфатические расстройства системы, такие как первичная лимфедема, лимфатических пороков и лимфатических опухолей редкие условия, которые вызывают значительную заболеваемость, но мало что известно об их биологии. Изоляция очень чистые человеческие лимфатические эндотелиальные клетки (МИК) от больных и здоровых тканей будет способствовать исследования лимфатической эндотелия у генетических, молекулярных и клеточных уровнях. Предполагается, что эти исследования могут выявить целевые показатели для новых методов лечения, которые могут изменить клиническую управление этими условиями. Протокол описания изоляции крайней плоти человека LEC, и лимфатической пороков развития лимфатических эндотелиальных клеток (LM) Lecs представлена. Для получения одного суспензии клеток ткани измельчают и ферментативно лечить с помощью диспазу II и коллагеназы II. В результате суспензию отдельных клеток, то помечены с антителами к кластер дифференцировки (CD) маркеров CD34, CD31, фактора роста эндотелия сосудов-3 (VEGFR-3) и PODOPLANIN. СтаиNED жизнеспособные клетки были отсортированы на флуоресцентно активированного клеточного сортера (FACS), чтобы отделить Поз PODOPLANIN Поз LM LEC население CD34 CD31 низкий Поз VEGFR-3 от других эндотелиальных и не-эндотелиальными клетками. Отсортированные LM МИК культивировали и расширил фибронектина покрытием колбы для дальнейшего экспериментального использования.
Введение
Основная функция лимфатической сосудистой системы, чтобы поглотить лимфы, избыток тканевой жидкости, содержащей липиды, белки и клеточные компоненты, и вести его к системе венозной крови. Сеть лимфатических капилляров лимфа направляет в лимфатические узлы, где она проверяется на наличие чужеродных антигенов, важного процесса в иммунного надзора и развертывания белых кровяных клеток, чтобы нейтрализовать чужеродные антигены.
Однонаправленный лимфатическая система начинает в тканях с начальной лимфатической капиллярной, уникальной структурой с разрывным одного слоя тонкостенных плоских эндотелиальных клеток со специализированными переходов,....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этика заявление: Этическое одобрение коллекции лимфатических пороков развития и крайней плоти тканей была получена из комитетов по этике научных исследований человека в Королевской детской больницы в Мельбурне, Австралия. Подписано согласие было получено от родителей пациентов до операции. Образцы тканей были собраны от пациентов с диагнозом лейомиом проходящих хирургических процедур в рамках их клинического управления и пациентов, перенесших выборные обрезание. Все эксперименты были проведены в соответствии с руководящими принципами национального здравоохранения и медицинского исследовательского совета, Австралии.
1. Подготовка клеточной с....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
После первоначального ткани пищеварения, после 24 часов в культуре нефракционированного образцов, отдельные колонии эндотелиальных клеток может наблюдаться (фиг.2А) вместе с фибробластоподобных клеток и клеток гладкой мускулатуры. После сортировки и после 24 часов в культуре клеток, то CD34 CD31 низкий Поз VEGFR-3 Поз Podoplanin Pos клетки приложить и показать типичный булыжник морфологии (рис 2B и C). Используя метод, описанный выше FAC.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
МИК играют важную роль в поддержании гомеостаза жидкости, иммунный ответ на чужеродные антигены и поглощения и транспорта некоторых питательных веществ. LEC гомеостаз могут быть затронуты болезненные процессы, такие как бактериальные инфекции и метастазов опухоли, но МИК может развиваться соматические мутации, которые приводят к образованию неблагополучных лимфатических сосудов и значительной заболеваемости для больных. Чтобы получить более глубокое понимание лимфатической пороков этиологии через имплантации в естес.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы хотели бы признать Бейкер фонд и «Женщины в науке» Товарищества Фонда Королевского Детские поддержке Zerina Lokmic. Андрей Г. Elefanty и Эдуард Г. Стэнли NHMRC Старшие научные сотрудники. Работа в лабораториях при поддержке NHMRC и стволовых клеток Австралии.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life Technologies (Gibco) | 11965-092 | Используется для сбора образцов тканей из операционной. |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | EGM-2 MV Bullet Kit содержит 500 мл среды EBM-2 и человеческого EGF, гидрокортизон, гентамицин (GA-1000), фетальную бычью сыворотку (FBS), VEGF, человеческий FGF-b, R3-IGF-1 и аскорбиновую кислоту. |
| VEGF-C | R& D Systems | 2179-VC-025 | Полная среда эндотелиальных клеток дополнена 50 нг/мл VEGF-C |
| Антимикотический раствор (100x) | Life Technologies (Gibco) | 15240-062 | Этот раствор содержит 10,000 ЕД/мл пенициллина, 10 000 мг/мл стрептомицина и 25 мг/мл антимикотика Фунгизона. Используйте в разведении 1:100. |
| Фибронектин из плазмы крови человека | Sigma-Aldrich | F2006 | Используется в концентрациях 10 мг/мл. Его можно повторно использовать до 1 месяца при хранении при 4 ° C и поддерживается в стерильном состоянии. Используйте 7 мл для покрытия 150 см<суп>2 колбы. |
| Реагент диссоциации клеток StemPro Accutase | Life Technologies (Gibco) | A11105-01 | StemPro® Accutase® Используется из расчета 0,05 мл на см<суп>2 для покрытия всей площади поверхности колбы. Использование меньшего объема может привести к неполному отслоению клеток. |
| 0,4% Трипановый синий краситель | Life Technologies (Gibco) | 15250-061 | Используется в качестве окрашивателя для жизнеспособности. |
| Dispase II | Roche Applied Biosciences | 4942078001 | используется в 0,04% |
| Коллагеназа II | Worthington Lab | 4176 | Используется в 0,25% |
| DNase I | Roche Applied Biosciences | 11284932001 | Используется в 0,01% |
| 70 мм нейлоновые клеточные фильтры | BD Falcon | 352350 | |
| [header] | |||
| PE-сопряженный клон VEGFR-3 9D9F9, клон WM59 | BioLegend | 356204 | Используется при разведении в соотношении 1:50 |
| PE-Cy7-конъюгированный CD34, клон 581 | BioLegend | 343516 | Используется в соотношении 1:200 |
| APC-конъюгированная мышь против человеческого CD31, клон WM59 | BioLegend | 303116, | используется в соотношении 1:100 |
| Alexa 488-конъюгированная крыса против человеческого подопланина, клон NC-80. | BioLegend | 337006 | Используется при разведении 1:200 |
| PE-конъюгированная мышь IgG1, k изотип, клон MOPC-21 | BioLegend | 400112 | Используется при разведении 1:50 |
| PE-Cy7-конъюгированная мышь IgG1, k изотип, клон MOPC-21 | BioLegend | 400126 | Используется при разведении 1:200 |
| APC-конъюгированная мышь IgG1, k изотип, клон MOPC-21 | BioLegend | 400120 | Используется при разведении |
| 1:100Alexa 488-конъюгированная мышь IgG2a, изотип k, клон RATK2758 | BioLegend | 400525 | используется в разведении 1:200 |
Ссылки
- Baluk, P., et al. Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels. J Exp Med. 204 (10), 2349-2362 (2007).
- Yao, L. C., Baluk, P., Srinivasan, R. S., Oliver, G., McDonald, D. M. Plasticity of ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
