В этом отчете представлено подробное описание трансплантации мышиной тимины от мышей разного возраста от донорских мышей разного возраста под почечную капсулу реципиентов иммунодефицитных мышей. Целью данного подхода является моделирование развития Т-клеток и событий отбора тимуса in vivo.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение и Трансплантация различных престарелых мышиных тимуса трансплантатов.
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Механизмы, которые регулируют эффективность тимуса выбора остаются плохо определены. Метод, представленный здесь позволяет в естественных условиях анализов разработки и отбора Т-клеток, специфичных для себя и чужеродных антигенов. Подход влечет за собой имплантацию тимуса трансплантатов, полученных от различных старых мышей в иммунодефицитных SCID получателей. За сравнительно короткий период времени получатели полностью восстанавливают Т-клеток, полученных из тимуса имплантированного трансплантата. Только тимоцитов посева тимус во время изоляции испытывают выбор и развиваться в зрелые Т-клеток. Таким образом, изменения в природе и специфичность Т-клеток привитых в зависимости от возрастных тимуса событий может быть оценена. Хотя техническая экспертиза необходима для успешного тимуса трансплантации, этот метод обеспечивает уникальную стратегию для изучения в естественных условиях широкий спектр патологий, которые из-за или в результате аномальной функции тимуса и / или гомеостазесть.
Введение
Тимус является органом, в котором критические события в развитии Т-клеток происходят 1. Резиденты тимоциты, на перестройкой Т-клеточного рецептора (TCR) α и β генов, пройти серию взаимодействий с lymphostromal и антиген-представляющих клеток (APC) в коркового и мозгового регионов тимуса 2. Тимуса позитивной селекции опосредуется корковых эпителиальных клеток тимуса (TEC) для получения тимоцитов, которые распознают антигенные пептиды в контексте принимающей главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I и II молекул 2-3. После тимуса влечет за собой негативный отбор очистку аутореактивных тимоцитов, приводимый от взаимодействия с медуллярной TEC или дендритных клеток (ДК), которые представляют пептидов, полученных из собственных белков, связанных с МНС класса I и II молекул 3. Конечным результатом этих процессов является создание пула клеток зрелой CD4 + и CD8 + Т способны реагировать на широкий спектрчужеродных антигенов время экспонирования минимальный реактивность собственных белков 4.
Эффективность тимуса событий отбора зависит от целого ряда факторов, в том числе тимуса созревания, частота мозгового и коркового TEC, подмножества состава тимуса, округ Колумбия, и источник тимуса прекурсоров 3. Следует отметить, что аберрантных тимуса выбор может привести к аутоиммунных 5 или иммунодефицитных патологий, возникающих из нарушенной отрицательной или положительной селекции, соответственно. Молекулярные события, регулирующие тимуса выбор, однако, плохо изучены. В пробирке подходов, таких как перегруппировываться тимуса культур органов (РИПЦ) 6, оказались полезны для анализа основных событий, связанных с вилочковой выбора, но не в полной мере воспроизводят динамику продолжается в естественных событий. В результате, это тимуса трансплантации подход был создан для более событий исследование отбора тимоцитов в естественных условиях 7 .
Этот протокол описывает пересадки thymi от новорожденных и взрослых мышей-доноров в иммунодефицитных SCID мышей-реципиентов. Эта методика позволяет исследовать механизмы, которые регулируют положительные и отрицательные тимуса выбор, а также в тимусе различных Т-клеточных подмножеств в онтогенезе. Совсем недавно этот подход был использован, чтобы продемонстрировать, что эффективность отбора тимуса ограничена в ранние сроки после рождения у мышей приводит к увеличению развития аутореактивных Т-клеток, и снижение Т-клеток репертуар специфичен для чужеродных антигенов 7.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Мышиные исследования были одобрены уходу и использованию комитета Институциональные животных (IACUC) из Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл и все по уходу за животными была в соответствии с руководящими принципами IACUC.
1. Подготовка новорожденных и взрослых Thymi
- Подготовьте все реагенты и оборудования перед эвтаназии мышей-доноров.
- Стерилизовать хирургических инструментов в автоклаве или других соответствующих методов. Все хирургические процедуры должны выполняться под колпаком с ламинарным потоком для поддержания стерильных условиях и избежать загрязнения. Соберите необходимые инструменты для извлечения из thymi мышей-доноров.
- Заполните 60 мм блюдо с стерильных 1x PBS (рН 7,4) и поместите на лед внутри капюшона. Это будет использоваться, чтобы кратко магазина thymi вырезали из мышей-доноров до трансплантации.
- По этических принципов, усыпить новорожденных мышей-доноров путем обезглавливания и взрослых доноров мышей CO 2 удушья с последующим смещением шейных позвонков.
- Для гemoval тимуса: Положите мышь в спинной лежачем положении на стерильной впитывающей бумажной салфеткой и спрей с 70% этанола до принятия разрез.
- Expose брюшной и грудной полости, делая срединный разрез через кожу. Сложите кожи на груди и передних конечностей, чтобы выявить грудной полости.
- Сделайте две боковые разрезы через диафрагму и грудную клетку, чтобы разоблачить превосходную средостение и передней грудной полости. Тимус должна быть видна в виде двух белых лепестков непосредственно над и рядом с сердцем.
- Дразнить кроме соединительной ткани, окружающей тимус с тонким пинцетом, убедившись, что не нарушить капсулу. В то время как сдерживает грудную клетку с пинцетом, используйте вторую пару щипцов извлечь две доли тимуса путем размещения изогнутые щипцы под орган и потянув вертикально. Это может быть сделано с помощью рассекает возможности для извлечения thymi от новорожденных мышей.
- Поместите тимус в 60 мм диш, содержащий стерильный 1x PBS (рН 7,4) на льду и отдельных тимуса долях путем перерезания соединительной перешейка. Удалите мусор из тимуса долях убедившись, чтобы не повредить капсулу, и сократить тимус в соответствующее число секций для трансплантации.
- Не манипулировать thymi полученную от новорожденных мышей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используется для максимум двух мышей-реципиентов (1 лепестков каждого получателя). - Пересадка в thymi полученной от взрослых мышей в максимум 4-6 мышей-реципиентов. Используя пару щипцов, тщательно понять одного взрослого тимуса лепесток, как показано на рисунке 1, вырезать тимус на три равные части, используя хирургические ножницы.
- Повторите шаги 1.3-1.4 для каждого донора мыши. Для того, чтобы ограничить время thymi подвергаются, подготовить 1 донорской тимус одновременно.
2. Тимус Имплантация Под почки Capsule
- Соберите заранее стерилизовать оборудование, перечисленное в таблице 1. Правильное асептическийТехника должна быть использована в течение процедуры, чтобы предотвратить разоблачение пересадкой получателей загрязненных инструментов или реагентов.
- До трансплантации, взвесить и маркировать каждый получатель мышь.
- Настройка рассекает микроскоп и анестезии замыкание в ламинарный.
- Использование электрической бритвой, бритье левую сторону мыши получателя и убедиться в отсутствии волос не остается вокруг области, используемой для изготовления разрез.
- Включите изофлуораном испаритель и обезболить мышь, используя дозу между 1-2%. Определить правильную обезболивания перед началом хирургической процедуры по проверке на отсутствие рефлекса следующей ног крайнем случае.
- После мышь правильно наркозом, применять мазь ветеринарная для глаз мыши, чтобы предотвратить сухость и подготовить мышь для трансплантации следующим образом:
- Расположите курсор под микроскопом рассекает в правой боковой лежачем положении, так что побрился стороной вверх. ЗАПУСКнг в центре хирургической области, обойтись в круговом движении с использованием одноразовые пипетки 70% этанола, а затем повидон-йода (бетадин). Повторите этанол / бетадин лечение 3 раза до принятия разрез.
- Использование рассечения ножницами сделать 1-2 см фланговый разрез непосредственно над почкой.
- Использование средних щипцов понять соединительной ткани, прилегающих к почке и осторожно поднимите почку так, что она лежит на вершине мускулатуры. Чтобы сохранить почку подвергается и в месте над мускулатурой, вставить одну руку из средних щипцов под почкой, уделяя особое внимание, чтобы не нарушить почечную подвздошной кости.
- Для того чтобы предотвратить высыхание ткани, орошают почку стерильной 1x PBS (рН 7,4) в течение каждой стадии до манипуляций с почек и почечную капсулу завершена.
- Использование тонких щипцов зажать и поднять капсулу на краю почки наиболее дистальной в надпочечники, чтобы отделить его от почки.
- Используйте 18 калибриглы, чтобы сделать надрез, достаточно большой, чтобы вставить подготовленную часть донорской тимуса (рис 2А). Убедитесь, чтобы капсульный разрез как можно меньше, чтобы предотвратить смещение имплантата в течение долгого времени.
- Держа капсулу оторвался от почки, использовать вторую пару тонких щипцов для вставки трансплантата под капсулой и нажать тимус, как далеко вперед от капсульного разреза, насколько возможно (фиг.2В).
- Удалите пинцетом из-под почки, и осторожно вернуть почку на место через разрез.
- Закройте мускулатуру путем наложения швов в брюшную стенку и применения бетадин раз закрыт. После наложения швов завершена, применяются раны клипы, чтобы закрыть дермы и применять бетадин в окрестностях.
- Верните мышь в клетку, которая была подогретой с помощью тепла лампы.
- Монитор каждый послеоперационную мышь, пока он не восстановит полное сознание и подвижность и не ставьте мышей ТНАт не восстанавливается следующим анестезии в клетку с другими животными.
- Лечить мышей с послеоперационными наркотиков управления боль по мере необходимости. Обеспечение мышей послеоперационных анальгетиков, таких как ацетаминофен в питьевой воде в концентрации 1,6 мг / мл.
- Повторите шаги 2.3-2.9 для каждой мыши-реципиента.
- Убедитесь, что у мышей, возвращение к нормальной деятельности в течение 1 ч после операции. Монитор послеоперационную вес, двигательные навыки, а также питьевой и кормления активность каждой мыши, чтобы определить, осложнения, возникающие в результате процедуры трансплантации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Послеоперационный потеря веса, по сравнению с дооперационной веса, а также измененной подвижностью или отказа, чтобы поесть или напиток может указывать осложнений. - Монитор Т-клеток воссоздание в периферической крови кровотечение мышей с помощью хвоста ник с последующим разделением лимфоцитов с использованием Lympholyte разделения клеток СМИ в соответствии с требованиями завода-изготовителя. Осуществлять Т-клеток characterizaции лимфоцитов окрашиванием с флуоресцентно конъюгированных антител, специфичных к Т-клеток маркеров CD3, CD4, и CD8, а также живой мертвой дискриминатора, таких как флуоресцентно активированным сукцинимидил эфира 8. Анализ, как показано на рисунке 3 может быть достигнуто с помощью стробирования на синглеты, живых клеток и CD3-положительных клеток.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Успех этой процедуры зависит от минимальной хирургической травмы, а также точного позиционирования трансплантата под почечную капсулу. Тимуса трансплантата должны быть сокращены, чтобы обеспечить соответствующего размера тимуса разделы для последующей трансплантации, как показано на рисунке 1. После схеме на рисунке 1, thymi от новорожденных или взрослых мышей могут быть использованы для успешной пересадки субкапсулярной с последовательной и воспроизводимые результаты приживления Т-клет...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
События, регулирующие отбор тимуса, плохо изучены. Последние исследования продемонстрировали онтогенные изменения в эффективности отбора. Сочетание этого подхода с различными трансгенными мышами-донорами и реципиентами тимуса еще больше облегчит исследования по выявлению событий и параметров, которые регулируют отбор тимуса. Примечательно, что трансплантация тимуса используется для лечения и контроля Т-клеточных расстройств и нарушений тимуса, наблюдаемых, например, у атимических младенцев без функциональных Т-клеток и у...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов, которые можно было бы раскрыть.
Благодарности
Эта работа была поддержана финансированием, полученным от Национальных институтов здравоохранения (1R01AI083269).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Этанол | Decon Laboratories | 2705HC | |
| PBS | GIBCO | 14190-144 | pH 7.4 |
| Раствор бетадина | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| Игла 18 калибра | BD | 305195 | |
| шовные материалы (1.0 метрические) | Ethicon | J493G | 18" (45см) |
| Зажимы для ран AUTOCLIP (9мм) | Clay Adams® Марка | 427631 | |
| Переводная пипетка | Fisher Scientific | 13-711-20 | Стерильная, одноразовая |
| мышь анти-CD3 Ab | eBioscience | 11-0031-85 | Клон: 1452C11 |
| Мышь анти-CD4 Ab | eBioscience | 48-0042-82 | Клон: RM4-5 |
| Мышь анти-CD8 Ab | eBioscience | 25-0081-82 | Клон: 53-6.7 |
| Ланцет | Medipoint | Goldenrod 4 мм | |
| Тихоокеанский апельсин Сукцинимидиловый эфир, соль триэтиламмония | Invitrogen | P30253 | |
| 96-луночные круглые боттонные полипропиленовые пластины | Corning | 3365 | |
| 1,2 мл полипропиленовые кластерные тубы | Corning | 4401 | |
| 5 мл полипропиленовые трубки с круглым дном | BD | 352002 | |
| 40 мкМ Нейлоновые элементы Ситечко | Falcon | 352340 | |
| 16% раствор параформальдегида, ЭМ класс | Услуги электронной микроскопии | 15710 | опасная |
| оптическая мазь Puralube | Fisher Scientific | NC0138063 | |
| лимфолит | Cedarlane | CL5030 | |
| 60 мм чашка для клеточной культуры | Corning | 430196 | 60 мм x 15 мм, стерильный |
Ссылки
- Kappler, J. W., Roehm, N., Marrack, P. T cell tolerance by clonal elimination in the thymus. Cell. 49 (2), 273-280 (1987).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat. Rev. Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nat. Rev. Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).
- Schwartz, R. H. Acquisition of immunologic self-tolerance. Cell. 57 (7), 1073-1081 (1989).
- Kishimoto, H., Sprent, J. A defect in central tolerance in NOD mice. Nat. Immunol. 2 (11), 1025-1031 (2001).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Investigating central tolerance with reaggregate thymus organ cultures. Methods. Mol. Biol. 380, 185-196 (2007).
- He, Q., et al. Thymic development of autoreactive T cells in NOD mice is regulated in an age-dependent manner. J. Immunol. 191 (12), 5858-5866 (2013).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Chapter 6. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Rice, H. E., et al. Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome: medical and surgical considerations. J. Pediatr. Surg. 39 (11), 1607-1615 (2004).
- Markert, M. L., et al. Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge Syndrome. N. Engl. J. Med. 341, 1180-1189 (1999).
- Market, M. L., Devlin, B. H., McCarthy, E. A. Thymus transplantation. Clin. Immunol. 135 (2), 236-246 (2010).
- Wells, A. D., Li, X., Strom, T. B., Turka, L. A. The role of peripheral T-cell depletion in transplantation tolerance. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 356 (1409), 617-623 (2001).
- Albuquerque, A. S., et al. Human FOXN1-Deficiency is associated with ab double-negative and FoxP3+ T-cell expansions that are distinctly modulated upon thymic transplantation. PLoS One. 7 (5), e37042(2012).
- Chinn, I. K., Milner, J. D., Scheinberg, P., Douek, D. C., Markert, M. L. Thymus transplantation restores the repertoires of forkhead box protein 3 (FoxP3)+ and FoxP3- T cells in complete DiGeorge anomaly. Clin Exp Immunol. 173 (1), 140-149 (2013).
- Savino, W. The thymus is a common target organ in infectious diseases. PLoS Pathog. 2 (6), e62(2006).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
Трансплантация тимусного трансплантатавыделение тимуса мышиимплантация под капсулу почкианализ методом проточной цитометрииоценка приживления Т-клетокиммунодефицитные мыши-реципиентыисследование тимусной селекциихирургическое позиционирование трансплантатареконституция периферических Т-клетоквозрастные изменения тимуса
