El sistema nervioso entérico está formado por células de la cresta neural que proliferan, migran y colonizan el intestino. Las células de la cresta neural se diferencian en neuronas con marcadores específicos para su fenotipo de neurotransmisor. Este protocolo describe una técnica de disección, fijación e inmunotinción del tracto gastrointestinal embrionario murino para visualizar la expresión de neurotransmisores del sistema nervioso entérico.
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Artículo de método
La inmunotinción para visualizar murino entérica Desarrollo del Sistema Nervioso
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Resumen
Resumen
El sistema nervioso entérico está formado por células de la cresta neural que proliferan, migran y colonizan el intestino. Después de la colonización, las células de la cresta neural deben diferenciarse en neuronas con marcadores específicos para su fenotipo de neurotransmisor. Las neuronas colinérgicas, un fenotipo de neurotransmisor importante en el sistema nervioso entérico, se identifican mediante tinción para la colina acetiltransferasa (ChAT), la enzima sintetizadora de la acetilcolina. Los esfuerzos históricos para visualizar las neuronas colinérgicas se han visto obstaculizados por anticuerpos con diferentes especificidades para el sistema nervioso central frente al sistema nervioso periférico ChAT. Nosotros y otros hemos superado esta limitación mediante el uso de un anticuerpo contra el ChAT placentario, que reconoce tanto el ChAT central como el periférico, para visualizar con éxito las neuronas colinérgicas entéricas embrionarias. Además, hemos comparado este anticuerpo con los reporteros genéticos de ChAT y hemos demostrado que el anticuerpo es más fiable durante la embriogénesis. Este protocolo describe una técnica de disección, fijación e inmunotinción del tracto gastrointestinal embrionario murino para visualizar la expresión de neurotransmisores del sistema nervioso entérico.
Introducción
Un funcionamiento del sistema nervioso entérico (ENS), que controla la motilidad, la absorción de nutrientes, y el flujo sanguíneo local, es esencial para la vida 1. El ENS está formado por células de la cresta neural (NCC) que proliferan, migran y colonizar el intestino, donde se diferencian en neuronas de los ganglios que contiene y células gliales. Enfermedad de Hirschsprung (herencia mendeliana HSCR, en línea en el hombre), un trastorno congénito multigeneic con una incidencia de 1 en 4.000 nacidos vivos, se puede considerar la enfermedad prototípico para el estudio de la formación de ENS interrumpido. En HSCR, NCC dejan de migrar y colonizar a longitu....
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Protocolo
La Universidad de Wisconsin Cuidado de Animales y el empleo Comisión aprobó todos los procedimientos.
1. Preparación de soluciones
- Utilice fosfato 1x solución salina tamponada (PBS) como tampón de disección y solución de lavado.
- Preparar 30% de sacarosa pesando 30 g de sacarosa y el lugar en una botella. Añadir 99 ml de 1x PBS y añadir 1 ml 10% de azida de sodio. Mezclar bien hasta que toda la sacarosa se disuelve. Almacenar a 4 ° C hasta que sea necesario.
- Preparar la solución de bloqueo mediante la mezcla de 1x PBS, 3% de albúmina de suero bovino (BSA) y 0,1% de Triton-X-100. Mezclar bien y guardar ....
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Resultados
Hemos descrito previamente la generación de ratones que expresan tanto las buenas prácticas agrarias y tdTomato reporteros fluorescentes que detectan la expresión de ChAT 14. En pocas palabras, los ratones chat-Cre se aparearon con R26R: floxSTOP: animales tdTomato para producir chat-Cre; R26R: ratones tdTomato (llamados chat-Cre tdTomato): floxSTOP. Estos animales fueron entonces aparearon con ratones reportero GFP-ChAT homocigotos. Se aislaron e.......
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Discusión
Nuestro laboratorio y otros han demostrado que los defectos intestinales en HSCR no se limitan al colon aganglionar pero extenderse proximalmente, incluso en el intestino delgado ganglionar 5,15,16. Estas alteraciones incluyen cambios en la densidad y ENS fenotipo neuronal neurotransmisor y puede dar cuenta de dismotilidad que se ha observado en pacientes con HSCR. Hemos utilizado las técnicas anteriores en nuestros esfuerzos para comprender los determinantes de la formación de la ENS. En concreto, estas técn.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado byThe Premio American Pediatric Surgical Association Foundation (AG) y los Institutos Nacionales de Salud K08DK098271 (AG).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución salina tamponada con fosfato | Oxoid | BR0014G | |
| sacarosa | Fisher | S2 | |
| Azida sódica | Fisher | BP9221 | |
| Albúmina sérica bovina | Fisher | BP1605 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Paraformaldehído | Sigma | 158127 | |
| 60 mm Placas de Petri | Fisher | FB0875713A | |
| Microscopio de fluorescencia | Nikon | SMZ-18 | |
| Microscopio de disección Estereoscopio | Nikon | SMZ-18 | |
| Pinzas finas | Herramientas de ciencia fina | 11252-20 | |
| Tubos Eppendorf de 1,5 ml | VWR | 20170-038 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, AL | 0100-01 | |
| Portaobjetos de vidrio | Fisher | 12-550-15 | |
| Cubreobjetos | VWR | 16004-330 | |
| Microscopio confocal | Nikon Nikon A1 | ||
| Nikon Elements | Nikon |
Referencias
- Gershon, M. D. Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system. Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a ....
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Reimpresiones y permisos
