Этот протокол детализирует метод, чтобы изолировать внеклеточные пузырьки (EVS), небольшие мембранные частиц, выпущенных из клеток, от всего лишь 10 мкл образцов сыворотки. Такой подход позволяет обойти необходимость ультрацентрифугированием, требуется только несколько минут времени для анализа и делает возможным выделение электромобилей из образцов ограниченных объемах.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Бумажные основе Приборы для выделения и характеристики внеклеточной пузырьков
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Внеклеточные пузырьки (EVS), мембранные частиц, выпущенных из различных типов клеток, провести большой потенциал для клинического применения. Они содержат кислоты и белка груз нуклеиновой и получают все большее признание в качестве средства межклеточной коммуникации, используемой как эукариот и прокариот клеток. Тем не менее, из-за их малого размера, текущие протоколы для выделения электромобилей часто занимает много времени, громоздка и требует больших объемов образцов и дорогое оборудование, например, ультрацентрифуге. Для устранения этих недостатков мы разработали на основе бумаги иммуноафинную платформу для разделения подгруппы электромобилей, который легко, эффективно, и требует выборки объемов столь же низко как 10 мкл. Биологические образцы могут быть пипеткой непосредственно на индикаторной бумаги зон, которые были химически модифицированы с молекулами захвата, которые имеют высокое сродство к определенным Е. поверхностных маркеров. Мы проверки анализа с помощью сканирующего электронного микроскопа (SEM), на бумажной основе фермента-сшитый immunosorbenт анализы (P-ELISA), анализ транскриптом. Эти бумажные устройства позволит изучение электромобилей в клинике и условий исследования, чтобы помочь продвинуть наше понимание EV функций в норме и патологии.
Введение
Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой гетерогенные мембранозные частицы размером от 40 нм до 5000 нм и активно высвобождаются многими типами клеток различными путями биогенеза1-9. Они содержат уникальные и отобранные подмножества ДНК, РНК, белков и поверхностных маркеров из родительских клеток. Их участие в различных клеточных процессах, таких как межклеточная коммуникация10, модуляция иммунитета11, ангиогенез12, метастазирование12, химиорезистентность13 и развитие глазных заболеваний9, получает все большее признание и вызывает большой интерес к их полезности в диагностике, прогностии, терапии ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Общая схема процедуры работы приводится на рис 1. Использование этических норм, мы собрали образцы крови у здоровых субъектов, и полученный водный образцы юмора у пациентов через ветеранов больницы Тайчжун (TCVGH), Тайчжун, Тайвань под IRB утвержденным протоколов ( IRB TCVGH No. CF11213-1).
1. Изготовление бумаги устройств
- Вырезать хроматографии бумагу в кругах 5 мм в диаметре, чтобы обеспечить тот же макет, как микротитрационном 96-луночного планшета. Бутерброд эти кусочки бумаги с двумя Листы из полистирола с зарегистрированным сквозных отверстий и ламината.
- Изменить бумаги устройств, использующих метод химического сопр....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Способность устройства бумаги, чтобы изолировать подгруппы электромобилей эффективно зависит от его высокой чувствительностью и специфичностью распознавания EV поверхностных маркеров. Стабильный модификация бумажных волокон с молекулами захвата достигается с помощью авидин-биотин химии, как описано в другом месте 28-30. Эффективность химической конъюгации и метода физической адсорбции оценивается с помощью флуоресценции на основе показаний. Индикаторной бумаги зоны получают в соответствии с шагом протокола 1).......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Наиболее важные шаги для успешного выделения подгрупп внеклеточных пузырьков являются: 1) хороший выбор бумаги; 2) стабильное и высокий уровень охвата молекул захвата на поверхности бумаги волокон; 3) правильное обращение с образцами; и 4) общая лаборатория гигиены практика.
Пористые материалы были использованы во многих недорогих и оборудования свободной анализов. Они могут иметь настраиваемый размер пор, универсальные возможности, низкая стоимость и высокое соотношение площади поверхности .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Благодарности
Эта работа была частично поддержана Тайваньского Национального научного совета grants- НСК 99-2320-B-007-005-MY2 (CC) и НСК 101-2628-E-007-011-MY3 (CMC) и Генерального ветеранов Больницы и системы высшего образования Тайваня совместной программы исследований (CC).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Хроматографическая бумага | GE Healthcare Life Sciences | 3001-861 | Whatman® Целлюлозная бумага Grade 1 |
| (3-Меркаптопропил) триметоксисилан | Sigma Aldrich | 175617 | Это химическое вещество вступает в реакцию с водой и влагой и должно наноситься внутрь наполненного азотом перчаточного мешка. Избегайте контакта с глазами и кожей. Не вдыхайте испарения и пары. |
| Этанол | Fisher Scientific | BP2818 | Absolute, 200 Proof, молекулярно-биологический класс |
| бычьего сывороточного альбумина (BSA) | BioShop Canada Inc. | ALB001 | Часто упоминается как фракция Кона V. |
| N-γ-малеимидобутироксисукцинимидный эфир (GMBS) | Pierce Biotechnology | 22309 | GMBS представляет собой амино-сульфгидрильный сшиватель. GMBS чувствителен к влаге. |
| Авидин | Пирс Биотехнология | 31000 | НейтрАвидин имеет 4 сайта связывания для биотина и его значение pI составляет 6,3, что более нейтрально, чем нативный авидин |
| биотинилированный мышиный анти-CD63 | Ancell | 215-030 | AHN16.1/46-4-5 |
| биотинилированный аннексин V | BD Biosciences | 556418 | Annxin V имеет высокое сродство к фосфатидилсерину (PS) |
| Первичный анти-CD9 и вторичный антитело | System Biosciences | EXOAB-CD9A-1 | Вторичное антитело представляет собой |
| пробирки для разделения сыворотки | BD Biosciences | 367991 | активатор сгустков и гель для разделения сыворотки |
| Аннексин V связывающий буфер | BD Biosciences | 556454 | 10x; разбавить до 1x перед использованием. |
| Набор субстратов TMB | BD Biosciences | 555214 | Набор содержит перекись водорода и 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (TMB) |
| [header] | |||
| Набор для выделения РНК | Life Technologies | AM1560 | MirVana Набор для выделения РНК |
| основе поливинилпирролидона Life | Technologies | AM9690 | Средство для выделения РНК растений содержит поливинилпирролидон (ПВП), который связывается с полисахаридами. |
| Набор для очистки РНК | Qiagen Inc. | 74004 | Набор для очистки РНК MinElute предназначен для очистки до 45 μ г РНК. |
| Плазменная камера | March Instruments | PX-250 | |
| Сканирующий электронный микроскоп | Hitachi Ltd. | Настольный сканер S-4300 | |
| компании Hewlett-Packard | Photosmart B110 | получил 8-битные цветные изображения. Также можно использовать фотоаппараты и смартфоны. | |
| Система записи изображений | J& Получены | Chemi-XX8 компании H Technology Co GeneSys G:BOX Chemi-XX8 | . Также можно использовать флуросцентные микроскопы. |
Ссылки
- Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).
- Lasser, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
