Naive CD4+ T-Zellen polarisieren in verschiedene Untergruppen, abhängig von der Umgebung zum Zeitpunkt der Aktivierung. Die Differenzierung naiver CD4+ T-Zellen zu verschiedenen Effektor-Untergruppen kann in vitro durch die Zugabe von T-Zell-Rezeptor-Stimuli und spezifischen Zytokinsignalen erreicht werden.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Antigen-unerfahrene (naive) CD4+ T-Zellen durchlaufen eine Expansion und Differenzierung zu Effektor-Untergruppen zum Zeitpunkt der T-Zell-Rezeptor (TCR)-Erkennung des verwandten Antigens, das auf MHC Klasse II präsentiert wird. Die Zytokinsignale, die zum Zeitpunkt der TCR-Aktivierung in der Umwelt vorhanden sind, sind ein wichtiger Faktor bei der Bestimmung des Effektorschicksals einer naiven CD4+ T-Zelle. Obwohl die Zytokinumgebung während der naiven T-Zell-Aktivierung komplex sein kann und in vivo sowohl redundante als auch gegensätzliche Signale enthält, kann die Zugabe verschiedener Zytokinkombinationen während der naiven CD4+ T-Zell-Aktivierung in vitro die Etablierung von Effektor-T-Helferlinien mit charakteristischer Zytokin- und Transkriptionsfaktorexpression leicht fördern. Solche Differenzierungsexperimente werden häufig als erster Schritt zur Bewertung von Zielen verwendet, von denen angenommen wird, dass sie die Entwicklung bestimmter CD4+ T-Helfer-Untergruppen fördern oder hemmen. Die Zugabe von Mediatoren, wie z. B. Signalagonisten, Antagonisten oder anderen Zytokinen, während des Differenzierungsprozesses kann auch verwendet werden, um den Einfluss eines bestimmten Ziels auf die T-Zell-Differenzierung zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein grundlegendes Protokoll für die Isolierung naiver T-Zellen aus der Maus und die nachfolgenden Schritte, die zur Polarisierung naiver Zellen zu verschiedenen T-Helfer-Effektorlinien in vitro erforderlich sind.
Einleitung
Das Konzept der verschiedenen Linien oder Teilmengen von CD4 + T-Helferzellen (Th) gibt es schon seit der zweiten Hälfte des 20. Jahrhunderts 1 gewesen. Anerkennung der verwandten Antigen in Gegenwart von kostimulatorischen Signalen resultiert in mehreren Runden der Zellproliferation und die eventuelle Differenzierung in Th-Zellen. Der Typ der Th-Zell während dieses Prozesses erzeugt wird, ist abhängig von der während der Aktivierung 2 vorhanden Zytokin-Umgebung. Anfänglich wurden naiven Th-Zellen vermutlich in 2 unterschiedliche Linien folgenden T-Zell-Rezeptor (TCR) Aktivierung kostimulatorischen CD28 Ligation und Zytokin....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Alle experimentellen Verfahren werden durchgeführt unter Verwendung von Protokollen vom Büro des Environmental Health and Safety an der Rosalind Franklin Universität für Medizin und Wissenschaft genehmigt. C57BL / 6-Mäuse (von NCI gekauft) für dieses Protokoll wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen untergebracht sind, und alle Tierversuche wurden unter Verwendung von Protokollen, die von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) genehmigten an der Rosalind Franklin Universität für Medizin und Wissenschaft.
1. Vorbereitung der Instrumente, Zubehör und Reagenzien
- Mantel mit 48 Vertiefungen oder 2....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Der Zeitpunkt für die Analyse der Differenzierung in Abhängigkeit von der Th Zustand variieren und getestet, wie die Stärke der T-Zell-Rezeptor-Aktivierung. Nach 2-3 Tagen der Differenzierung, können die Zellen durch Lichtmikroskopie sichtbar gemacht, um das Ausmaß der T-Zellproliferation zu bestimmen. Wells umfassenden Proliferation und Verklumpung der Zellen, die wahrscheinlich für die Analyse am Tag 4. Differenzierung Bedingungen sich auf die Zugabe von exogenem IL-2, wie Th1 und Th2 ist, wird wahrscheinlich erschöpf.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Während die Milz naiven Th-Zellen enthält, ist der Anteil dieser Population in Lymphknoten viel höher. Eine nicht fachgerechte Ermittlung und Beseitigung Lymphknoten in diesem Protokoll wird in einer schlechten Ausbeute von naiven Zellen führen. Dies kann besonders schwierig bei älteren Mäusen oder männlichen Mäusen, die mehr Fettgewebe haben. Wie in Abbildung 1, die richtige Befestigung und Verstiftung der tierischen Gliedmaßen und der Haut gezeigt werden zur leichteren Visualisierung der zugänglichen .......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Danksagungen
Die Autoren bedanken sich bei allen Mitgliedern der Reynolds Labor an Rosalind Franklin Universität für Medizin und Wissenschaft, und das Chen Dong Labor an der University of Texas MD Anderson Cancer Center für die Optimierung dieses Protokolls zu danken. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss zu JMR von der National Institutes of Health (K22AI104941) unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Vollständiges RPMI: | Vor Gebrauch in einem 37 C Wasserbad erwärmen | ||
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-Glutamin | Life Technologies | 25030081 | |
| 120 Mikron Nylonnetz | Amazon | CMN-0120-10YD | In 2 cm2 Quadrate schneiden und autoklavieren |
| Alternativ: 100 Mikron Zellsiebe | Fisher | 08-771-19 | Alternative zum Schneiden von Nylongewebe |
| autoMACS Laufpuffer | Miltenyi | 130-091-221 | Vor Gebrauch in einem 37 oC Wasserbad erwärmen |
| autoMACS Spüllösung | Miltenyi | 130-091-222 | Vor Gebrauch in einem 37 oC Wasserbad erwärmen |
| CD4Kügelchen | Miltenyi | 130-049-201 | |
| ACK Lysepuffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Zytokine: | |||
| Mensch (h) IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| Rekombinante Maus (rm) IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| rmIL-6 | R & D Systems | 406-ML-025 | |
| rmIL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| hTGFb | R & D Systems | 240-B-010 | |
| Antikörper: | |||
| 2C11 (anti-CD3) | BioXcell | BE0001-1 | |
| 37.51 (anti-CD28) | BioXcell | BE0015-1 | |
| 11B11 (anti-IL-4) | BioXcell | BE0045 | |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | BioXcell | BE0055 | |
| anti-CD62L-FITC | BioLegend | 104406 | Verwendung bei 1:100 |
| anti-CD25-PE | BioLegend | 102008 | Verwendung bei 1:400 |
| anti-CD4-PerCP | BioLegend | 100434 | Verwendung bei 1:1000 |
| anti-CD44-APC | BioLegend | 103012 | Verwendung bei 1:500 |
| Phorbol 12-Myristat-13-acetat (PMA) | Sigma-Aldrich | P-8139 | einer Brühe von 0,1 mg/ml in DMSO und Einfrieren von Aliquoten bei -20 oC |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I-0634 | Bereiten Sie eine Brühe mit 0,5 mg/ml in DMSO vor und frieren Sie die Aliquoten bei -20 oC |
| Brefeldin A | eBioscience | 00-4506-51 | Bei 1:1000 verwenden |
Referenzen
- Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol. 136 (7), 2348-2357 (1986).
- Dong, C., Flavell, R. A.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
