Le cellule T CD4+ ingenue si polarizzano in vari sottoinsiemi a seconda dell'ambiente al momento dell'attivazione. La differenziazione delle cellule T CD4+ naive in vari sottogruppi di effettori può essere ottenuta in vitro attraverso l'aggiunta di stimoli recettoriali delle cellule T e segnali specifici delle citochine.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule T CD4+ inesperte (naïve) dell'antigene subiscono espansione e differenziazione in sottogruppi effettori al momento del riconoscimento del recettore delle cellule T (TCR) dell'antigene affine presentato su MHC classe II. I segnali delle citochine presenti nell'ambiente al momento dell'attivazione del TCR sono un fattore importante nel determinare il destino effettore di una cellula T CD4+ naïve. Sebbene l'ambiente delle citochine durante l'attivazione delle cellule T naive possa essere complesso e coinvolgere sia segnali ridondanti che opposti in vivo, l'aggiunta di varie combinazioni di citochine durante l'attivazione delle cellule T CD4+ naive in vitro può facilmente promuovere la creazione di linee di helper T effettrici con l'espressione di citochine e fattori di trascrizione caratteristici. Tali esperimenti di differenziazione sono comunemente usati come primo passo per la valutazione di bersagli che si ritiene promuovano o inibiscano lo sviluppo di alcuni sottogruppi di helper T CD4+. L'aggiunta di mediatori, come agonisti di segnalazione, antagonisti o altre citochine, durante il processo di differenziazione può anche essere utilizzata per studiare l'influenza di un particolare bersaglio sulla differenziazione delle cellule T. Qui, descriviamo un protocollo di base per l'isolamento di cellule T naive dal topo e i passaggi successivi necessari per polarizzare le cellule naive a vari lignaggi di effettori T helper in vitro.
Introduzione
Il concetto di linee o di sottoinsiemi di CD4 + T helper distinti (gi), le cellule è stato intorno dal momento che la seconda metà del 20 ° secolo 1. Riconoscimento dell'antigene cognate in presenza di segnali di costimolazione risultati in vari cicli di proliferazione cellulare e l'eventuale differenziazione in cellule effettrici Th. Il tipo di cellule Th generati durante questo processo dipende sull'ambiente citochina presente durante l'attivazione 2. Inizialmente, le cellule Th naive sono stati pensati per polarizzarsi in 2 linee distinte seguenti recettore delle cellule T (TCR) attivazione, costimolazion....
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Protocollo
Tutte le procedure sperimentali sono eseguite utilizzando protocolli approvati dall'ufficio di salute ambientale e sicurezza presso l'Rosalind Franklin University of Medicine and Science. C57BL / 6 topi (acquistato da NCI) utilizzato per questo protocollo è stato ospitato in condizioni esenti da organismi patogeni specifici, e tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti utilizzando i protocolli approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) presso l'Rosalind Franklin University of Medicine and Science.
1. Preparazione di strumenti, accessori e reagenti
- Coat 48 pozzetti o 24....
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Risultati
Il punto di tempo per l'analisi di differenziazione può variare a seconda della condizione Th in prova e la forza di attivazione del recettore delle cellule T. Dopo 2-3 giorni di differenziamento, le cellule possono essere visualizzati al microscopio ottico per determinare l'entità della proliferazione delle cellule T. Wells espositrici vasta proliferazione e aggregazione delle cellule saranno molto probabilmente pronti per l'analisi al giorno 4. Condizioni di differenziazione si basa su l'aggiunta di es.......
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Discussione
Mentre la milza contiene cellule Th naïve, la percentuale di questa popolazione in linfonodi è molto più alta. La mancata corretta identificazione e rimozione dei linfonodi in questo protocollo si tradurrà in una scarsa resa di cellule naïve. Questo può essere particolarmente difficile in topi di età superiore o topi maschi che hanno più tessuto grasso. Come mostrato in Figura 1, fissaggio e spinatura corretta degli arti animali e la pelle consentirà di facilitare la visualizzazione dei linfonodi estern.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri del laboratorio di Reynolds a Rosalind Franklin University of Medicine and Science, e il laboratorio di Chen Dong presso l'Università del Texas MD Anderson Cancer Center per l'ottimizzazione di questo protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione per JMR dal National Institutes of Health (K22AI104941).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| RPMI completo: | Riscaldare in un bagno d'acqua a 37 oC prima dell'uso | ||
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoetanolo | Life Technologies | 21985023 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 100X 15140122 | |
| 100X L-glutammina | Life Technologies | 25030081 | |
| rete di nylon da 120 micron | Amazon | CMN-0120-10YD | Taglio in quadrati da 2 cm2 e autoclave |
| Alternativa: filtri cellulari da 100 micron Fisher | 08-771-19 | Alternativa al taglio della rete di nylon | |
| tampone di corsa autoMACS | Miltenyi | 130-091-221 | Scaldare a bagnomaria a 37 oC prima dell'uso |
| Soluzione di risciacquo autoMACS | Miltenyi | 130-091-222 | Scaldare a bagnomaria a 37 oC prima dell'uso |
| Perle CD4 | Miltenyi | 130-049-201 | |
| tampone di lisi ACK | Life Technologies | A10492-01 | |
| Citochine: | |||
| Umane (h) IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| Topo ricombinante (rm) IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| rmIL-6 | R & D Systems | 406-ML-025 | |
| rmIL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| hTGFb | R & D Systems | 240-B-010 | |
| Anticorpi: | |||
| 2C11 (anti-CD3) | BioXcell | BE0001-1 | |
| 37.51 (anti-CD28) | BioXcell | BE0015-1 | |
| 11B11 (anti-IL-4) | BioXcell | BE0045 | |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | BioXcell | BE0055 | |
| anti-CD62L-FITC | BioLegend | 104406 | Utilizzare a 1:100 |
| anti-CD25-PE | BioLegend | 102008 | Utilizzare a 1:400 |
| anti-CD4-PerCP | BioLegend | 100434 | Utilizzare a 1:1000 |
| anti-CD44-APC | BioLegend | 103012 | Utilizzare a 1:500 |
| Phorbol 12-miristato 13 acetato (PMA) | Sigma-Aldrich | P-8139 | Preparare un impasto a 0,1 mg/ml in DMSO e congelare le aliquote a -20 oC |
| Ionomicina | Sigma-Aldrich | I-0634 | Preparare un impasto a 0,5 mg/ml in DMSO e congelare le aliquote a -20 oC |
| Brefeldin A | eBioscience | 00-4506-51 | Utilizzare a 1:1000 |
Riferimenti
- Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol. 136 (7), 2348-2357 (1986).
- Dong, C., Flavell, R. A.
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Ristampe e permessi
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