Макрофаги печени, называемые клетками Купфера, отвечают за захват циркулирующих наночастиц. Здесь мы описываем метод выделения клеток Купфера, обладающий высокой чистотой клеток и выходом. Модифицированный анализ LDH используется здесь для измерения токсичности, индуцированной углеродными нанотрубками в клетках Купфера.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Купфер Выделение клеток для наночастиц токсичности тестирования
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Большинство в пробирке nanotoxicological исследований использовали увековечены клеточных линий для их практичности. Тем не менее, результаты испытаний на токсичность наночастиц в бессмертных клеточных линий или первичных клеток показали расхождения, подчеркнув необходимость расширить использование первичных клеток для анализов в пробирке. Этот протокол описывает выделение макрофагами печени мышей, названные клетки Купфера, и их использование для изучения наночастиц токсичности. Купфер клетки наиболее распространенным населения макрофагов в организме и составляют часть ретикуло-эндотелиальной системы (РЭС), ответственного за захват циркулирующих наночастиц. Способ изоляции клеток Купфера сообщалось здесь, основан на методе 2-ступенчатой перфузии с последующей очисткой по градиенту плотности. Метод, основанный на коллагеназы пищеварения и центрифугирования в градиенте плотности, приспособлен от оригинального протокола, разработанного Smedsrød др. предназначен для крыс isolatio клеток печенин и обеспечивает высокий выход (до 14 × 10 6 клеток на мышь) и высокой чистоты (> 95%) в клетках Купфера. Этот метод изоляции не требует сложного или дорогостоящего оборудования и, следовательно, представляет собой идеальный компромисс между сложностью и выходом клеток. Использование более тяжелых мышей (35-45 г) улучшает выход способа выделени, но также облегчает заметно процедуру катетеризации воротной вены. Токсичность функционализированных углеродных нанотрубок F -CNTs измеряли в этой модели с помощью модифицированного LDH анализа. Этот метод оценивает жизнеспособность клеток путем измерения отсутствие структурной целостности клеточной мембраны купферовских после инкубации с F -CNTs. Токсичность индуцируется F -CNTs может быть измерена с помощью последовательно этот анализ, подчеркнув, что изолированные клетки Купфера полезны для тестирования наночастиц токсичности. Общая понимание нанотоксикологии могли извлечь выгоду из таких моделей, что делает выбор наночастиц для клинического перевода более эффекциент.
Введение
Поле нанотоксикологии исследований направлена охарактеризовать биологическое действие наночастиц. Токсикологические исследования, основанные на исследованиях в естественных условиях остаются наиболее точных методов. Тем не менее, их применение ограничено их стоимости, трудовых и временных требований 1. Как анализы альтернатив, в пробирке были использованы из-за их простоты и возможности разработки высокой пропускной в пробирке тестирования платформ 2 - так увеличения количества тестируемых условиях. Большинство nanotoxicological исследования проводили с использованием в анализах пробирке с иммортали....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты на животных были выполнены в соответствии со всеми соответствующими руководящими принципами, правилами и регулирующими органами. Протокол демонстрируется была выполнена под руководством и утверждении Положения внутренних дел Великобритании
1. перфузии и сбора клеток (рисунок 1)
Рисунок 1:. Печень перфузии после анестезии мыши, желудочно-кишечного тракта в боковом перемещении влево живота для того, чтобы в портальную вену (PV) доступной. П.В. канюлю с помощью медленной скоро....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Количество не очищенных паренхиматозных клеток согласуется и колебалась между 8 и 14 х 10 6 клеток на мышь (проводились 17 изоляция). Каждый изоляция мыши было достаточно, чтобы пластина 16 до 28 скважин. Жизнеспособность клеток путем окрашивания трипановым синим показала жизнеспособность клеток ~ 95%. Клетки Купфера показали круглую форму в течение 30 мин инкубации при 37 ° С, в связи с их неполной клейкого морфологии (фиг.4А). В 4 часа инкубации и впоследствии клетки распространились и клет.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Следующие шаги имеют решающее значение для достижения высокой урожайности и высокой жизнеспособности клеток Купфера. Асептических условиях должны быть использованы, чтобы снизить риск бактериального и грибкового загрязнения. Все инструменты должны быть стерилизованы перед использованием. Реагенты должны быть свежеприготовленной перед проведением процедуры выделения.
Выбор коллагеназы IV с низкой активностью трипсином, имеет решающее значение. Различные много из того же поставщика есть другой.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана программой EU FP7-ITN Marie-Curie Network RADDEL. MB и KAJ выражают благодарность Джо Варгезе и Руи Серра Майя за их помощь и предложения по оптимизации выделения клеток Купфера.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Эутатал (пентобарбитал натрия) | Мышей Merial | ||
| CD1 | Charles River | - | Вес мыши должен варьироваться от 35 до 45 г. Мы рекомендуем использовать самцов мышей CD1, так как их вес быстро увеличивается (<например>например вес самца мыши CD1 в возрасте 7 недель превышает 35 г). Также рекомендуется заранее связаться с поставщиком животных, чтобы договориться о доставке более старых животных. В качестве альтернативы животные могут находиться в помещении для достижения желаемого веса. |
| HBSS (Ca2+ и Mg2+ free, с бикарбонатом) | Технологии жизни | 14175-053 | HBSS должен быть Ca2+ бесплатно. |
| Этиленгликоль тетрауксусная кислота (EGTA) тетранатриевая соль | Сигма-Олдрич | E8145 | ЭДТА также может быть использована, но EGTA имеет преимущество в хелатировании Ca2+ селективно. |
| ГЕПЕС (1 М) | Технологии жизни | 15630-056 | 100 мл |
| Коллагеназа типа IV | Уортингтон | CSL-4 | Рекомендуется протестировать разные партии коллагеназы или хотя бы сообщить поставщику, что продукт должен быть пригодным для выделения клеток печени. |
| Низкий уровень глюкозы DMEM | Сигма-Олдрич | D5523 | 500 мл |
| RPMI (с пируватом натрия и глутамаксом) | Технологии жизни | 12633-012 | 500 мл |
| Пенициллин/Стептомицин | Технологии жизни | 15140-122 | 100 мл |
| Фетальная бычья сыворотка | Первая-ссылка | 60-00-850 | 500 мл |
| Раствор трипана синего | Сигма-Олдрич | Т8154 | 100 мл |
| Покрытый раствор частиц диоксида кремния (Percoll) | GE Healtcare | 17-0891-02 | Percoll® очень стабилен и может храниться в течение нескольких лет; |
| 1x Фосфатно-солевой буфер | Технологии жизни | 10010-023 | 500 мл |
| 10x Фосфатно-солевой буфер | Технологии жизни | 70011-036 | 500 мл |
| Диметилсульфоксид | Рыбак | D/4120/PB08 | 500 мл |
| Набор для ЛДГ (CytoTox 96) | Promega | G1781 | Хранить в защищенном от света месте; |
| ДММ фенол красный свободный Life | Technologies | 31053-028 | 500 мл |
| F4/80 антитело (Alexa 488) | AbD Serotec | MCA497A488 | Не разбавлять, используется в чистом виде для проточной цитометрии |
| Флуоресцентные шарики | Sigma | L2778 | Латексные шарики, аминомодифицированный полистирол, флуоресцентный красный. 1 мл |
| Название материала | Компания | Каталожный номер | Комментарии/Описание |
| Набор для сбора крови бабочек (трубка длиной 23 г/305 мм) | BD | ||
| Шприцевые фильтры (0,22 μ m Blue Rim) | Минисарт | 16534-K | |
| Центрифужные пробирки (50 мл Blue Cap) | BD Biosciences, Falcon | 35 2070 | |
| Чашка Петри (90 x 15 мм) | Thermo Fisher Scientific | BSN 101VR20 | |
| 100 μ Ситечко для клеток M | BD | 352360 | |
| Перистальтический насос | Уотсон Марлоу | SciQ 300 | Промывайте трубки до и после каждого использования стерильным PBS и 70% этанолом. |
| 24-луночные планшеты | Corning | 3526 | |
| 96-луночные планшеты | Corning | 3595 | |
| Центрифуга | Eppendorf | 5810R | |
| Считыватель пластин | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
| Serrefine щипцы | Hammacher GmbH | Арт. No HSE 004-35 / Кат. No 221-0051 | Зубчатые щипцы позволяют зажимать сосуд, канюлированный иглой 23 G, без необходимости удерживать щипцы во время процедуры перфузии. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) |
| Пробирки проточной цитометрии | BD Biosciences, Falcon | ||
| Микроцентрифуга пробирки (1,5 мл) | Elkay | 000-MICR-150 | |
| Скребок для клеток | BD Biosciences, Falcon | 353086 | Разрежьте лезвия конечностей с помощью ножниц для соскабливания клеток в 24-луночных планшетах. |
| Наименование компании, производящей реагенты | Каталожный номер | Комментарии/Описание | |
| Раствор EGTA (Этиленгликоль тетрауксусная кислота)/HBSS (Сбалансированный раствор соли Хэнка) | HBSS, содержащий 0,5 мМ EGTA и 25 mM HEPES. Отрегулируйте pH до 7,4. Приготовьте по 50 мл на каждую печень для перфузии. | ||
| Раствор коллагеназы | DMEM с низким содержанием глюкозы, содержащая коллагеназу IV типа в дозе 100 ЕД/мл, 15 мМ HEPES и 1% пеникллин/стрептамицин (v/v). Отрегулируйте pH до 7,4. Приготовьте по 100 мл на каждую печень для перфузии. После добавления коллагеназы рекомендуется прогреть раствор в течение 30 минут перед использованием. Это позволяет проводить оптимальную активность коллагеназы. | ||
| Среда для выделения клеток Kupffer | RPMI содержит, 1% заменимых аминокислот (v/v), 1% глутамакс® (v/v) и 1% пеникллин/стрептомицин (v/v). Приготовьте не менее 100 мл на 1-3 печени. | ||
| Среда для культивирования клеток Kupffer | RPMI содержит 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% заменимых аминокислот (v/v), 1% глутамакс® (v/v) и 1% пеникллин/стрептамицин (v/v). Приготовьте не менее 100 мл на 1-3 печени. | ||
| SIP (раствор изотонически покрытых частиц диоксида кремния) | Смешайте 1,7 мл 10x фосфатного буферного раствора с 15,3 мл Percoll® для получения 17 мл SIP. | ||
| 25% SIP решение | Смешайте 5 мл SIP с 15 мл 1x Фосфатно-солевой буфер | ||
| 50% SIP решение | Смешайте 10 мл SIP с 10 мл 1x Фосфатного буферного раствора | ||
| Лизисный буфер | DMEM media с 0,9% раствором | ||
| PBS/BSA | Приготовьте свежий фосфатный буферный физиологический раствор pH 7,4 с 1% бычьего сывороточного альбумина. |
Ссылки
- Hoffmann, D., et al. Performance of novel kidney biomarkers in preclinical toxicity studies. Toxicol Sci. 116 (1), 8-22 (2010).
- Nel, A., et al. Nanomaterial Toxicity Testing in the 21st Ce....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
