מולקולרי הבדיקה אופטימיזציה לקביעת תמותת תא באורגניזם פוטוסינתזה (<em&gt; Aeruginosa Microcystis</em&gt;) שימוש cytometry הזרימה

סיכום

אוכלוסיות חיידקים מכילות ההטרוגניות תא משמעותית, אשר יכול להכתיב התנהגות כוללת. ניתוח בדיקה מולקולרי באמצעות cytometry זרימה יכול לקבוע מדינות פיסיולוגיות של תאים, עם זאת היישום שלה משתנה בין מינים. מחקר זה מספק פרוטוקול לקבוע תמותת תאים בתוך אוכלוסיית cyanobacterium במדויק, בלי להמעיט או הקלטת תוצאות חיוביות שגויות.

תקציר

תת-אוכלוסיות חיידקים במחקרי שדה ומעבדה הוכחו להציג גבוהה ההטרוגניות בפרמטרים מורפולוגיים ופיסיולוגיים. קביעת המצב בזמן אמת של תא חיידקים חורג קטגוריות חיות או מתות, כחיידקים יכולים להתקיים במצב רדום, לפי חלוקת תאים ופעילות מטבולית מופחתות. בהתחשב בצורך באיתור וכימות של חיידקים, cytometry זרימה (FCM) עם בדיקות מולקולריות מספקת שיטה מהירה ומדויקת כדי לקבוע את הכדאיות אוכלוסייה כללית. באמצעות Sytox הירוק וSytox אורנג 'כבחוליות מודל Microcystis aeruginosa לזהות שלמות קרום, אנו מפתחים שיטה להעברה לאינדיקציה מהירה של תמותת תא בודדת. הבדיקות מולקולריות המשמשות בכתב עת זה תופנה לבדיקות חומצות גרעין ירוקות או כתומות כבהתאמה (אם כי יש מוצרים אחרים עם אורכי גל עירור ופליטה דומים שיש לי מצבים דומים כיצד תפעלn, אנו מתייחסים באופן ספציפי לקדמת הבמה ציינו בדיקות). פרוטוקולים באמצעות בדיקות מולקולריות להשתנות בין מינים, שונים בעיקר בזמני ריכוז ודגירה. בעקבות פרוטוקול זה יצא לM.aeruginosa הבדיקה חומצות גרעין הירוקה הייתה מותאמת בריכוזים של 0.5 מיקרומטר לאחר 30 דקות של דגירה והבדיקה הכתומה חומצות הגרעין במיקרומטר 1 לאחר 10 דקות. בשני ריכוזי הבדיקות פחות מאופטימלית האמור הוביל לתחת דיווח של תאים עם נזק קרום. לעומת זאת, 5 מיקרומטר ריכוזים וגבוהים בשתי הבדיקות הפגינו סוג של כתמים שאינם ספציפיים, לפיה תאים "חיים" המיוצרים על הקרינה יעד, שמוביל לייצוג יתר של מספרים סלולריים "שאינם בר-קיימא". הבקרות החיוביות (-נהרג חום) הניתנות ביומסה המתה הניתנת לבדיקה, אם כי ההתאמה של דור שליטה נשארת נושא לדיון. על ידי הוכחת רצף הגיוני של צעדים לייעול הבדיקות הירוקות וכתומות חומצות גרעין אנחנו דהmonstrate כיצד ליצור פרוטוקול שניתן להשתמש כדי לנתח מצב פיסיולוגי cyanobacterial ביעילות.

מבוא

התא הוא מערכת מורכבת, שמגיבה כל הזמן לסביבה על ידי שינוי פרמטרים פיסיולוגיים ולשנות את תפקודו. הדינמיקה של אוכלוסיות חיידקי אוכלוסיית isogenic הן בטבע והמעבדה מושפעות מההתפתחות של תת-אוכלוסיות, המתרחשת גם בתנאים סביבתיים קבועים יחסית ^{1 - 3.} ההשתנות של קהילות חיידקים טבעיות מתעוררת בשל האופי משתנה מאוד של תנאים סביבתיים. תהליכים סטוכסטיים לפעמים אלה לאחר מכן לייצר תת-אוכלוסיות ששונות מאוד לממוצע האוכלוסייה. העדויות אחרונות גילו כי תת-אוכלוסיות הפיזיולוגיות אלה מגיבות באופן שונה לתנאי סביבה ויכולות לייצר תרכובות אות או מעכבים שלהשפיע באופן דרמטי ולהשפיע על ^3,4 האוכלוסייה הכללית.

פרוטוקול

1. הכנה של החללית המולקולרית וcytometer הזרימה

1. לדלל פתרונות מניות של בדיקות חומצות גרעין, אשר מסופקות כפתרון 5 מ"מ בdimethylsulfoxide (DMSO) לaliquots של ריכוזים הנדרשים בultrapure המסונן H ₂ O.
2. אחסן את בדיקות חומצות גרעין בתנאים חשוכים בין -5 ^מעלות צלזיוס ו-- 25 ^o C עד שימוש.
3. הפעל את cytometer הזרימה וחבילת תוכנת עומס (ראה טבלה של חומרים / ציוד למפרטי FCM).
4. ....

תוצאות

פיזור אור קדימה (FSC) ותפוקות צד פיזור אור (SSC) מתרבות אצווה M.aeruginosa בשלב מעריכי מספק מידע על גודל תא (קוטר) וגרעיניות פנימית בהתאמה (איור 1 א). FSC יכול להפלות תאים כי הם גדולים מדי ו / או קטנים להיות M.aeruginosa. אפליה או gating ניתן לעשות זאת על ידי נתונים זיקוק בין נקודות מסוימות של תפוקת FSC (איור 1 ג). Phycocyanin, חוקה עיקרית של מנגנון הפוטוסינתזה M.aeruginosa מייצרת אות חזק.......

דיון

המספרים מוגברים של פרסומים באמצעות בדיקות מולקולריות מציין שניתן להשיג נתונים אמינות ואינפורמטיבי ^{5,6,8 - 15,19,22,23.} כמו של עוד אין כתם מושלם לכדאיויות תא שיכול להיות יעיל בכל המינים באותה עת ריכוז ודגירת ^6,10. אפילו אותו הסוג של בדיקה עם פליטת הקרינה שינה מציג צורך בהקמה זמן ריכוז ודגירה הנכון (לוחות 1 ו -3). כפי שניתן לראות בעת השימוש בפרוטוקול זה, ריכוז ודגירת הזמן האופטימלי לבדיקת חומצת גרעין כתומה הוא 10 דקות במיק.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Cyanobacteria Media	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 תמיסה מרוכזת במים מתוקים (דילול x50)
נוזל טיהור	BD Biosciences	653155	לפעול למשך 2 דקות כאשר התפוקות הן יותר מ-12 אירועים לשנייה במהירות או בקצב זרימה של 66 ומיקרו; ליטר/מינימום  לאחר מכן 2 דקות של נדן H2O.
ציטומטר זרימה	BD Biosciences	לפי בקשה	BD Accuri C6
SYTOX Green	Life Technologies	S7020	כתם חומצת גרעין – תמיסה של 5 מ"מ ב-DMSO
SYTOX Orange	Life Technologies	S11368	כתם חומצת גרעין – תמיסה של 5 מ"מ ב-DMSO