El estudio de la función de proteínas y el Papel de la expresión de la proteína alterada por la interferencia de anticuerpos y reconstrucciones tridimensionales

Resumen

El control de la expresión de proteínas no solo es esencial para todos los organismos vivos, sino también una estrategia importante para investigar las funciones de las proteínas en modelos celulares. El protocolo presentado muestra la aplicación de la interferencia de anticuerpos en células de mamíferos, incluidas las neuronas primarias del hipocampo, y demuestra el uso de reconstrucciones tridimensionales en el estudio de la función de las proteínas.

Resumen

Una gestión estricta de la expresión de proteínas no sólo es esencial para todos los organismos vivos, sino también una estrategia importante para investigar las funciones de proteínas en modelos celulares. Por lo tanto, la investigación reciente inventado diferentes herramientas para dirigir la expresión de proteínas en líneas de células de mamífero o incluso modelos animales, incluyendo ARN y la interferencia de anticuerpos. Mientras que la primera estrategia ha recogido mucho la atención durante las últimas dos décadas, los péptidos que median una translocación de cargas de anticuerpos a través de las membranas celulares y en las células, obtuvieron mucho menos interés. En esta publicación, se proporciona un protocolo detallado cómo utilizar un portador de péptido llamado Chariot en células de riñón de embriones humanos, así como en las neuronas del hipocampo primarias para llevar a cabo experimentos de interferencia de anticuerpos y ilustrar adicionalmente la aplicación de las reconstrucciones en tres dimensiones en el análisis de la función de proteínas. Nuestros hallazgos sugieren que Chariot es, probablemente debido a su señal de localización nuclear, particularly bien adaptado a proteínas diana que residen en el soma y el núcleo. Sorprendentemente, cuando se aplica a cultivos de hipocampo Chariot primarios, el reactivo resultó ser sorprendentemente bien aceptado por las neuronas disociadas.

Introducción

Un control estricto de la expresión de la proteína es esencial para todos los organismos vivos para comandar su propio desarrollo, así como para reaccionar a las señales ambientales. Por lo tanto, una multitud de mecanismos se ha inventado durante la evolución de regular con precisión el nivel de expresión de cada proteína codificada por la aplicación. 20.000 genes existentes en cualquier célula eucariota en un momento dado de su vida. Que tienen lugar en diferentes etapas de la producción de proteínas, los mecanismos de regulación van desde la gestión de la estructura de la cromatina, la transcripción y ARN manipulación a la dirección de las modificaciones posterior....

Protocolo

1. Soluciones de archivo

1. Resuspender el polvo motivo activo liofilizado en _H2O estéril a una concentración final de 2 mg / l. Golpee suavemente para mezclar.
2. Preparar alícuotas pequeñas (por ejemplo, 12 l cada uno, se requieren 2 l por reacción) y almacenar a -20 ° C.

2. Preparación de células

1. De semillas de células de mamífero tales como células HEK293 o neuronas primarias en un medio de crecimiento placa de 24 pocillos en 500 l incluyendo antibióticos.
   NOTA: Al usar las neuronas, sembrar las células a baja densidad y utilizar sólo las dos filas intermedias de la placa de 2....

Resultados

En los párrafos siguientes, los resultados de ejemplo que ilustran una caída funcional de un POI (Simiate, para más detalles, véase ^{16, 17)} usando el reactivo Chariot y la interferencia de anticuerpos se presentan. Los resultados demuestran que la disminución de la expresión de Simiate deteriora la actividad transcripcional, y, en una forma dependiente de la dosis, induce la apoptosis, que culmina en las tasas de mortalidad de más del 99% si se aplican cantidades de anticuerpos más altos.......

Discusión

A continuación, se presenta un protocolo para estudiar la importancia de los niveles de expresión de proteínas en el control de las funciones celulares de una manera impulsada dosis. El protocolo descrito permite una manipulación afinado de expresión de la proteína en varios tipos de células de mamíferos, incluyendo las neuronas del hipocampo, por lo tanto, facilitar los estudios detallados de función de la proteína en el nivel celular.

A pesar de la interferencia de ARN representa una estra.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Carro	Active Motif	30025	tienda en -20 ° C
Medio neurobasal	Life technologies	21103-049	calentamiento hasta 37 ° C antes de usar
1x tecnologías B27	Life	17504044	almacenar a -20 ° C
L-glutamina	Life technologies	25030-149	tienda a -20 ° C
Penicilina y estreptomicina	Life technologies	15140-122	tienda a -20 ° C
Imaris software	Bitplane	n.a.caro	, pero inigualable
Microscopio de Barrido Láser	Zeiss	n.a.