הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הרחבת בידוד והתרבות של תאי האנדותל גידול ספציפי

10.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53072

⸱

14 באוקטובר 2015

 ,  , 
1Department of Cell Biology & Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina at Chapel Hill, 3McAllister Heart Institute, University of North Carolina at Chapel Hill

במאמר זה

סיכום

אנו מדווחים על שיטה אמינה לבידוד ותרבית תאי אנדותל ראשוניים ספציפיים לגידול ממודלים של עכברים מהונדסים גנטית.

תקציר

תאי גידול ספציפי מבודדים טרי אנדותל (TEC) יכולים לשמש כדי לחקור מנגנונים מולקולריים של אנגיוגנזה גידול ולשמש כמודל במבחנה לפיתוח מעכבי אנגיוגנזה חדשים לטיפול בסרטן. עם זאת, לטווח ארוך בהרחבת מבחנה של תאי האנדותל עכברי (EC) הוא מאתגר עקב סחיפה פנוטיפי בתרבות (מעבר אנדותל לmesenchymal) וזיהום עם לא-אירופי. זה נכון במיוחד עבור TEC הoutcompeted בקלות על ידי fibroblasts-מטוהר שיתוף או תאים סרטניים בתרבות. הנה, שיטת בידוד איכות גבוהה שמנצלת העשרת immunomagnetic בשילוב עם מבחר מושבה ובהרחבת מבחנה מתוארת. גישה זו יוצרת שברי EC טהורים שהם חופשיים לחלוטין של זיהום תאי סטרומה או גידול. כמו כן הוא הראה שcre Cdh5-לייחס שושלת: העכברים / ליטר ZsGreen s / l כתב, בשימוש עם הפרוטוקול מתואר במסמך זה, הינו כלי רב ערך כדי לוודא תאטוהר כמושבות EC המבודדות מעכברים אלה מראה הקרינה ZsGreen עמידה ומבריקה בתרבות.

מבוא

תאי האנדותל (EC) הם חיוניים במהלך הפיתוח של גידולים מוצקים. מייזום מתג angiogenic בגידולים רדומים להפצה וזריעה של גרורות באתרים מרוחקים, EC ליצור צינורות המספקים דם, חמצן וחומרים מזינים כדי לקיים את צמיחת גידול 1. כפי שהוצע לאחרונה, EC יש גם פונקציות זלוף-עצמאי ויוצר נישה שתומכת בצמיחה של תאי גזע סרטני ותאי סטרומה גידול אחרים 2-5. לפיכך, מטוהר ביותר גידול ספציפי EC (TEC) לתרבות במבחנה מאפשר ללימודים תפקודיים שיגרתי שישפוך אור על מנגנונים מולקולריים רומן תיווך אנגיוגנזה גידול ולדבר לחצות עם תאים סרטניים.

EC הם מאוד מיוחדים בהתאם לרקמת המוצא 6. בשל האופי הטרוגני סוגים שונים של גידול ומייקרו-הסביבה של הגידול, TEC יכול גם להציג תכונות ייחודיות המשקפות את גידול o התמחות ספציפיו בכלי הדם. לדוגמא, יש שונות בולטות בחתימות ביטוי גנים בTEC מבודדות מסוגים או ציונים של גידולי 7,8 שונים. עם זאת, שיתוף טיהור תכופה של אי-EC, במיוחד fibroblasts הקשורים גידול ותאים סרטניים, עם TEC יכולה לבלבל ביטוי הגנום מנתח. סוגי התאים לא רצויים אלה הם בעייתיים במיוחד במחקרים המסתמכים על טווח ארוך בהרחבת מבחנה של תרבויות TEC.

שתואר כאן היא שיטה באיכות גבוהה שמייצרת באופן עקבי תרבויות EC טהורות מגידולים ורקמות אחרות. בעקבות העשרת עמודת immunomagnetic של שברים EC והסרת מטוהר שיתוף הלא-EC, צעד שיבוט-טבעת נוספת כדי ללכוד מושבות EC טהורות משמשת 9. כל מושבה ניתן להרחיב בתרבות לקטעים מרובים ללא ההופעה של זיהום שאינו EC. שיטה זו גם תשואות שיבוטים EC מרובים מהליך בידוד יחיד, שהוא אידיאלי ללימוד אנדוההטרוגניות thelial. בנוסף, הוא הראה כי cre Cdh5: עכברי הכתב / L / L ZsGreen שלהם כלי רב ערך ליצירת EC "ממופה גורל" ובל יימחו-מסומן אשר לשמור על הקרינה ZsGreen בתרבות 10. עם התאמות קלות לפרוטוקול, שיטה זו צריכה להיות להתאמה לסוגי גידולים שונים או רקמות נורמליות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול הבא מתבצע על פי הנחיות שנקבעו על ידי המחלקה לבעלי חיים במעבדה לרפואה באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל.

1. מכין את החומר וריאגנטים הבאים לפני שמתחיל

  1. הכן תקשורת EC על ידי השלמה הנמוך גלוקוז 400 מיליליטר השתנה בינוני של הנשר (DMEM) עם 50 מיליליטר סרום חום מומת שור עוברי, 50 מיליליטר נו-סרום IV, 5 מיליליטר אנטיביוטיקה antimycotic, (ז 1 / D-גלוקוז או L LG) של Dulbecco וhFGF, VEGF, hEGF, R3-IGF-1, ורכיבי הפרין מהערכה המסחרית.
  2. הכן חיץ 500 מיליליטר FACS (BSA 0.5% ו- 2 mM EDTA ב PBS); לסנן באמצעות כוס סינון סטרילי 0.22 מיקרומטר.
  3. לעקר או לחטא לנתח לוח.
  4. לעקר סיכות לנתיחה, מספריים כירורגיות, ומבתרים.

2. בידוד EC (יום 1, ~ שעה 5)

  1. להרדים עכבר עם פחמן דו חמצני או בשיטות אחרות שנינות תואמותמדיניות h ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדית (IACUC).
    הערה: גידולי החלב מרובים משתנים בגודלם (5 - 15 מ"מ קוטר) עלולים לפתח בעכבר מהונדס גנטי בודד כגון C3-תג, כדי להיות בטוח לקצור את כולם לבידוד TEC. אם משתמשים בגידולי הengrafted orthotopically בעכברים, בריכה שתיים עד שלוש 1 סנטימטר 3 גידולים לבידוד EC יחיד. כאן אנו משתמשים גידולי החלב כהפגנה, אבל הפרוטוקול יכול להיות שונה עבור סוגים אחרים של גידולים.
  2. לחטא עכבר על ידי ריסוס או לנגב את צד הגחון העכבר עם כמות גדולה של אתנול 75% V / V.
  3. לכרות גידולים עם זוג אחד של מספריים ומבתרים תוך שימוש בטכניקות אספטיים במנדף סטרילי או בספסל נקי.
    1. להשתרע ולהצמיד את הגפיים של העכברים על לוח לנתח. לעשות חתך הגחון קו האמצע עם המספריים מבלי לפתוח את הצפק. לנתח רוחבי בין העור והצפק לבלוטות החלב שבו גידולים ממוקמים.אל תפתח את הצפק.
    2. בלו רק רקמת גידול מבלוטות החלב, ומשאיר את שוליים החלב רגילים. לקצץ בזהירות את רקמות שאינן סרטניים כגון עור ושרירים, ולמקם את הגידולים גזור בצינור חרוטי המכילים 30 מיליליטר של LG-DMEM על קרח.
  4. להביא דגימות גידול למכסה מנוע תרבית רקמה; לשטוף רקמות עם LG-DMEM סטרילי 1 - 2 פעמים.
  5. העברת גידולים מצינור חרוטי לצלחת פטרי רקמות תרבות סטרילי, להוסיף 2 מיליליטר של LG-DMEM בצלחת, ובררו עם זוג המספריים סטרילי לחתיכות <5 מ"מ.
  6. הוסף 5 מיליליטר של collagenase (מניות = 2 מ"ג / מיליליטר במאוזן מלח הפתרון של האנק, להלן HBSS), 1 מיליליטר של dispase (מניות = 2.5 U / ml בHBSS) ו -75 μl של deoxyribonuclease (מניות = 1 מ"ג / מיליליטר PBS ) לצלחת פטרי. נפח כולל הוא עכשיו ~ 10 מיליליטר.
  7. העבר את תערובת collagenase / רקמות מצלחת פטרי לצינור רקמות Dissociator ולרוץ על Dissociator רקמה למשך 60 שניות פעמיים (שנקבע מראש ניתוק יחסי הציבורogram על Dissociator: 1,270 סיבובים הכולל להפעלה). דגירה עם אור רועד על שייקר במשך 75 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
  8. מסנן מתעכל רקמת דרך מסננת תא 100 מיקרומטר על צינור חרוטי 50 מיליליטר. מסנן לשטוף עם 5 מיליליטר של חיץ FACS לשטוף את כל תאים שנותרו. ספין ב 280 XG במשך 5 דקות ולשאוב supernatant בזהירות מבלי להפריע תא גלולה.
  9. לדלל 1 מיליליטר של חיץ מניית RBC תמוגה (10x) ב 9 מיליליטר של מים סטריליים. תאי דם אדום Lyse עם 10 מיליליטר של חיץ תמוגה (1x), ומייד ספין 5 דקות ב 280 x גרם. הערה: ניתן לדלג על שלב זה אם הדם קטן גלוי.
  10. Resuspend ב 10 מיליליטר של חיץ FACS. מערבבים 10 μl של השעיה תא עם 10 μl של trypan כחול, ולספור תאי חיים באמצעות hemocytometer.
  11. Resuspend תאים ב ~ 10 7 תאים / μl 100. הוסף 10 μl של בלוק FCR להשעית תא 100 μl, דגירה על קרח למשך 10 דקות.
  12. הוסף נוגדן CD31 עכברוש אנטי עכבר PE-מצומדות פי. לטבלת 1 לדגור על קרח במשך 10 - 15 דקות וצינור קפיצי מדי פעם.
  13. להוסיף 10 מיליליטר של חיץ FACS לצינור והספין ב 280 XG במשך 5 דקות. מוציא בזהירות את supernatant, ולשטוף את התא גלולה שוב עם 5 מיליליטר של חיץ FACS. צנטריפוגה לגלולת תאים. לשאוב supernatant ללא תא גלולה מטריד.
  14. להוסיף microbeads חיץ ואנטי-PE FACS לפי טבלה 2 לדגור על קרח במשך 10 -. 15 דקות. צינור קפיצי מדי פעם.
  15. להוסיף 10 מיליליטר של דגימות חיץ וספין FACS ב 280 XG במשך 5 דקות; לשטוף פעם אחת עם 5 מיליליטר של חיץ FACS ו צנטריפוגות שוב. לשאוב supernatant בלי גלולה מטרידה.
  16. תביא נפח 300 μl במאגר FACS. ספין באמצעות 35 דקות צינור 5 כתרים מיקרומטר תא-מסננת ב 280 x גרם. השתמש 2 צינורות ונפח גדול יותר במידת צורך.
  17. הגדרת multistand מגנטי ועמודות מגנטיות במכסת מנוע, לצרף לעמודה מפרידה ולאזן את העמודה עם 2 מיליליטר של חיץ FACS.
  18. Aspiratדואר supernatant ו resuspend התא גלולה ב0.5-1 מיליליטר של חיץ FACS.
  19. להעביר את ההשעיה התא דרך העמודה המגנטית equilibrated.
  20. לשטוף את העמודה שלוש פעמים עם 2 מיליליטר של חיץ FACS, ולאסוף זרימה דרך (FT) בצינור 15 מיליליטר (חלק FT).
  21. קח את הטור את המפריד וelute עם 2 מיליליטר של חיץ FACS לעוד 15 צינור מיליליטר (חלק eluate). השתמש בוכנה כדי להבטיח את כל התאים מהטור. חזור על elution עוד פעמיים עם 2 מיליליטר של חיץ FACS בכל פעם.
  22. ספין eluate ב 280 XG במשך 5 דקות.
  23. הסר את supernatant ו resuspend גלולה ב 10 מיליליטר של תקשורת EC.
  24. באותה מידה לחלק את חלק eluate (~ 6 מיליליטר) לתוך מנות ג'לטין מצופה 10 סנטימטר. במשך שלושה 1 סנטימטר 3 גידולים, צלחת eluted תאים בלפחות ארבע צלחות. תאים לחלופין, צלחת eluted בריכוזים שונים בצלחות מרובות (לדוגמא., זרע 0.5 מיליליטר, 1 מיליליטר, 1.5 מיליליטר, ו -3 מיליליטר של eluate לארבע צלחות) כדי להבטיח שצלחת לא לפחות אחד זרע בדלילות עם תאי eluted. בדוק שconfluency של התאים המצורפים הוא ב~ 1% ביום שלמחרת (כלומר, 1.0 כ - 2.0 X 10 5 תאים מצורפים).
    הערה: התאים צריכים להיות מצופים דליל כך שמושבות EC יכולות ליצור מבלי שזוהמה על ידי סוגי תאים אחרים.
  25. צלחת שבריר FT בצלחת 10 סנטימטר אחד כדי לאפשר לתאים להתאושש O / N. בדוק שהצלחת היא 80 - 100% ומחוברות למחרת. להקפיא את התאים (-80 ° C) בתקשורת 250 μl הקפאת תאים בcryotube ולאחסן אותם בחנקן נוזלי למחרת. הערה: חלק FT יכול לשמש לבידוד תאים סרטניים בשלב מאוחר יותר ו / או כביקורת שלילית לניתוח ביטוי גני EC של השיבוטים EC המבודדים.
  26. לשנות תקשורת כל 2 - 3 ימים. מושבות מתחילות טופס לאחר 7 - 10 ימים. ניתן לזהות מושבות EC קטנות כבר ביום 3. מארק המושבות עם סמן עדין קצה בתחתית הצלחת.
  27. לגרד ג אינו ספציפיאמות המקיפות את המושבות המזוהות עם קצה pippet 200 μl סטרילי.

3. טבעות שיבוט שימוש מושבה בחירה

  1. לשנות תקשורת כל 2 - 3 ימים. טוהר EC ניתן לבדוק על ידי ה- LDL (DiI-AC-LDL) בנוסף על כ 5 - 7 ימים. הוסף 50 μl של LDL לכל 10 מיליליטר בינוני EC ודגירה של 3 - 4 שעות לפני בדיקת התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
    הערה: LDL מרובה + השיבוטים EC יכול להיבחן ב~ יום 7.
  2. התחל קצירת מושבות EC, כאשר הם מגיעים בקטרים ​​של 3 - 5 מ"מ בגודל. (בחר מושבות גדולות כי הם ארוזים עם LDL תאים + קטנים לתוצאות הטובות ביותר.)
  3. לפני קצירת EC עם טבעות שיבוט, מראש מעיל כמה 6-גם צלחות עם ג'לטין 0.5%. ג'לטין לשאוב, להוסיף 2 מיליליטר של תקשורת EC היטב כל אחד, ולשמור על הצלחות בחממה עד צורך.
  4. לגרד את הלא-EC בשולי המושבות כדי לוודא שאין סוגי תאים אחרים יהיה לכוד בתוך טבעת השיבוט.
  5. שימושמיקרוסקופ שלב בניגוד (אובייקטיבי 4X או 10X), מתאר בסמן עדין קצה בתחתית צלחת תרבות האזורים המכילים מושבות EC.
  6. לשטוף את הצלחת עם 10 מיליליטר של PBS ולהשאיר שכבה דקה מאוד של PBS בצלחת כאשר aspirating. (חשובה: כמות קטנה (~ 0.5 מיליליטר) של PBS ישמור תאי חיים במהלך הליך שיבוט-טבעת; גם, דבק רקמות זקוק למים כדי להתחבר.)
  7. בחר טבעת שיבוט של גודל מתאים. השתמש זוג המלקחיים לנתח להרים טבעת, ועם קצה pipet 10 μl באופן שווה להחיל כמות קטנה של דבק רקמות על טבעת השיבוט.
    הערה: השתמש רק בסכום מינימאלי (~ 0.2 μl לטבעת קטנה) של דבק רקמות על טבעות שיבוט, ולהפוך את דבק רקמות בטוח פרוש באופן שווה סביב המשטח התחתון, כדי להבטיח אטימה טובה. דבק רקמות מוגזם מייצר חום ויוצר סרטים שעלולות להרוג את התאים.
  8. מניחים את הטבעת על שיבוט המושבה EC. לחץ בעדינות את טבעת השיבוט להדביק ריng לצלחת. ודא שהמושבות לא התייבשו לפני הדבקת הטבעת.
  9. מייד pipet 25 μl של פתרון ניתוק תא האנזימטית לזירת שיבוט דגירה דקות ~ 1 או עד שהתאים מחוברים באופן רופף.
  10. תאי Pipet בטבעת שיבוט ירידה מבחינת לתוך היטב אחד של צלחת 6 היטב המכילה תקשורת EC המחוממת מראש. (חשוב: אין לטלטל את הצלחת לפזר תאים; EC מעדיף לגדול באשכולות צפופים.) שטוף את טבעת השיבוט עם 50-100 תקשורת EC μl לאסוף תאים רבים ככל האפשר, ולהעביר את כל שטיפות לתוך אותו 6-גם .
  11. אם כמה מושבות בצלחת 10 סנטימטר קטנות מדי כדי לקצור, להוסיף 10 מיליליטר תקשורת טרי, תן ​​לגדול המושבות לעוד כמה ימים, ולחזור על התהליך שוב טבעת השיבוט.
  12. לגדול מושבות שנקטפו ב6-גם צלחות עד 80 - ומחוברות 100%, והעברת תאים עד 3 בארות של צלחת 6 היטב, לפני הרחבתם בצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים. לגרד את תאים מזהמים. חזורסיבוב של הליך טבעת שיבוט אחר (שלבי 3.5-3.10) במידת צורך. שמור את התאים יחסית מחוברות (~ 60 - 70%), כאשר הרחבת. EC יכול להפסיק לגדול אם מצופה דליל מדי.
  13. לאפיין EC על ידי FACS, צביעה, PCR, וכו 'שים לב שדיל-AC-LDL הוא ניאון ועלול להפריע לPE או נוגדני ניאון אחרים לFACS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

EC מייצג רק קטין חלק מכלל אוכלוסיית התא ברוב הרקמות בוגרות 11. לכן חשוב לעיכול הרקמה שנקטפו במלואו לתוך השעיה תא בודד שמבטיחה את השחרור המקסימאלי של EC ממטריצה ​​תאית (ECM) ורקמות חיבור. מניסיוננו, בחירת immunomagnetic תיווך CD31 מספקת רק שברי EC מועשר אבל לא טהורים; לכן, עוד צעד מכריע היא ההסרה הפיסית של אי-EC-מטוהר שיתוף ובחירה / הרחבה של מושבות EC באמצעות טבעות שיבוט (איור 1). לדוגמא, כאשר CD31 מועשר EC היו מצופים ללא בחירת מושבה נוספת, במהירות התרבו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בשל הקשיים בהשגת תרבויות TEC העיקרי טהורות, רב במחקרי מבחנה TEC תחליף עם קווים זמינים מסחרי EC או EC העיקרי כגון וריד טבור האנושי EC (HUVEC) 13. עם זאת, אוכלוסיות אלה EC מרקמות נורמליות יכולות רק לשמש כמדד לTEC אשר נבדלים במידה ניכרת מעמיתיהם הרגילים. לדוגמא, TEC הם phenotypically ותפקודי נורמלי in vivo וחלק מהליקויים אלה עשוי להיות transmittable במבחנה 14-18. יש לי TEC צמיחה, נדידה, ויכולות הבחנה חריגות ועשוי להתגבש עם תאי CD31

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

ACD נתמך על ידי מענק מהמכון הלאומי לבריאות (R01-CA177875). LX הוא עמית בתוכנית לרפואה תרגומית במימון HHMI ב-UNC Chapel Hill. JVM נתמך על ידי מלגת קדם-דוקטורט T32 מהתוכנית לביולוגיה אינטגרטיבית של כלי הדם ב-UNC Chapel Hill. אנו מודים לקלייטון דייוויס על הסיוע במיקרוסקופיה קונפוקלית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית Sigma-AldrichA5955
מדיום הנשר השונה של Dulbecco (1 גרם/ליטר D-גלוקוז) (LG-DMEM)Gibco11885-084
ערכת כדורים EGM-2 LonzaCC4176לא כל הרכיבים בשימוש
סרום בקר עוברי (Hyclone)ThermoScientificSH30071.03חום מושבת ב-56 מעלות; C למשך 30 דקות
Nu-Serum IVCorningCB-51004
תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBBS)Gibco14175-095
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)Gibco14190-144
מאגר FACS 0.5% BSA ו-2 מ"מ EDTA ב-PBS, מסוננים דרך 0.22 μ מסנן
M 75% v/v אתנול לחיטוי
מיקרו-חרוזים נגד PE Miltenyi Biotech130-048-801
אלבומין בסרום בקר (BSA) חלק V, 7.5%Gibco15260-37
אמצעי הקפאת תאים (Bambanker)Wako Chemicals302-14681
קולגנאז מסוג II   וורת'ינגטון ביוכימיהLS004176הפוך את ריכוז המלאי 2 מ"ג/מ"ל ב-HBSS
Deoxyribonuclease I (DNase)Worthington BiochemicalLS002004הפוך את ריכוז המלאי 1 מ"ג/מ"ל ב-PBS
Dil-Ac-LDLBiomedical TechnologiesBT-902
EDTA, 0.5M, pH 8.0Cellgro46-034-CL
תמיסת ניתוק תאים אנזימטית (Accutase)Sigma-AldrichA6964-100ML
ג'לטין, 2% במים, דרגת תרבית רקמותSigma-AldrichG1393-100MLמדלל ב-PBS לייצור תמיסת ג'לטין 0.5%
מגיב חוסם FCR של עכבר Miltenyi Biotech130-092-575
פרוטאז ניטרלי (Dispase)Worthington BiochemicalLS02104הכינו ריכוז מלאי 2.5 U/ml ב-HBSS
PE-rat אנטי-עכבר CD31 נוגדןBD Pharmingen553373
RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse)BD Pharmingen555899
מים
טריפאן כחול, 0.4% Life Technologies15250-061
כלי תרבית רקמה 10 מ"מקורנינג
15 מ"ל (סטרילי)קורנינג
50 מ"ל צינורות חרוטיים (סטריליים) קורנינג
6 בארותקורנינג
(gentleMACS) צינורות C) Miltenyi Biotech130-093-237
מפריד תאים  (מידימק)Miltenyi Biotech130-042-302
מסננת תאים 100 μ מ קורנינג352360
טבעות שיבוט (גדלים שונים)מוצרי בל-ארט378470000
Cryotubes
לעקר או לחטא עם 75% אתנול v/v לפני השימוש 
ניתוח מלקחיים ומספרייםלעקר לפני השימוש 
סיכות חיתוך 2 אינץ'לעקר לפני השימוש 
צינורות FACS עם 35 μ m מכסה מסנןקורנינג352235
פילטר (Stericup, 0.22 μ m)MilliporeSCGPU05RE
סמן
Hemocytometer
עמודותLS Miltenyi Biotech130-042-401
מעמד מגנטיMiltenyi Biotech130-042-303
דבק רקמות (Vetbond)
Eppendorf5810Rאו צנטריפוגה בעלת קיבולת דומה לצנטריפוגה של 15 מ"ל ו-50 מ"ל צינור חרוטי
קולט אדים
דיסוציאטור רקמות (gentleMACS)Miltenyi Biotech130-093-235תוכנית מוגדרת מראש "m_impTumor_01" המשמשת לפירוק רקמות 
חנקן נוזלי
מיקרופלייט או שייקר
מיקרוסקופ
סטריליים צינורות חרוטיים לוחות תרבית רקמות צינורות דיסוציאטור רקמות לוח חיתוך תרמו מדעי קצה עדין צנטריפוגה 3M 1469SB לתרבית רקמותמקפיא סיבובי אור ניגודיות פאזה

מקורות

  1. Folkman, J. Anti-angiogenesis: new concept for therapy of solid tumors. Ann. Surg. 175 (3), 409-416 (1972).
  2. Butler, J. M., Kobayashi, H., Rafii, S. Instructive role of the vascular niche in promoting tumour growth and tissue repair by angiocrine factors. Nat. Rev. Cancer. 10 (2), 138-146 (2010).
  3. Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Stromal endothelial cells directly influence cancer progression. Sci. Transl. Med. 3 (66), 66ra5(2011).
  4. Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).
  5. Beck, B., et al. A vascular niche and a VEGF-Nrp1 loop regulate the initiation and stemness of skin tumours. Nature. 478 (7369), 399-403 (2011).
  6. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (1), a006429(2012).
  7. Dudley, A. C. Tumor endothelial cells. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (3), a006536-a006536 (2012).
  8. Aird, W. C. Molecular heterogeneity of tumor endothelium. Cell Tissue Res. 335 (1), 271-281 (2009).
  9. Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein. J. Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).
  10. Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
  11. Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).
  12. Xiao, L., Harrell, J. C., Perou, C. M., Dudley, A. C. Identification of a stable molecular signature in mammary tumor endothelial cells that persists in vitro. Angiogenesis. 17 (3), 511-518 (2014).
  13. Beijnum, J. R., et al. Gene expression of tumor angiogenesis dissected: specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature. Blood. 108 (7), 2339-2348 (2006).
  14. McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nat. Med. 9 (6), 713-725 (2003).
  15. Baluk, P., Hashizume, H., McDonald, D. M. Cellular abnormalities of blood vessels as targets in cancer. Curr. Opin. Genetics Dev. 15 (1), 102-111 (2005).
  16. Ghosh, K., et al. Tumor-derived endothelial cells exhibit aberrant Rho-mediated mechanosensing and abnormal angiogenesis in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (32), 11305-11310 (2008).
  17. Amin, D. N., Hida, K., Bielenberg, D. R., Klagsbrun, M. Tumor endothelial cells express epidermal growth factor receptor (EGFR) but not ErbB3 and are responsive to EGF and to EGFR kinase inhibitors. Cancer Res. 66 (4), 2173-2180 (2006).
  18. Hida, K., et al. Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities. Cancer Res. 64 (22), 8249-8255 (2004).
  19. Dudley, A. C., et al. Calcification of multipotent prostate tumor endothelium. Cancer Cell. 14 (3), 201-211 (2008).
  20. Dunleavey, J. M., et al. Vascular channels formed by subpopulations of PECAM1(+) melanoma cells. Nat. Comm. 5, 5200(2014).
  21. St Croix, B., et al. Genes expressed in human tumor endothelium. Science. 289 (5482), 1197-1202 (2000).
  22. Bhati, R., et al. Molecular characterization of human breast tumor vascular cells. Am. J. Pathol. 172 (5), 1381-1390 (2008).
  23. Johnson, C. S., Chung, I., Trump, D. L. Epigenetic silencing of CYP24 in the tumor microenvironment. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (1-2), 338-342 (2010).
  24. Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. J. Cell Biol. 60 (3), 673-684 (1974).
  25. Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299 (3), H837-H846 (2010).
  26. Zhang, J., Burridge, K. A., Friedman, M. H. In vivo differences between endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries revealed by microarray analysis. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295 (4), H1556-H1561 (2008).
  27. Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circ. Res. 99 (8), 861-869 (2006).
  28. Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. -H., Bischoff, J. Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31 (3), 598-607 (2011).
  29. Ginsberg, M., et al. Efficient direct reprogramming of mature amniotic cells into endothelial cells by ETS factors and TGFβ suppression. Cell. 151 (3), 559-575 (2012).
  30. Sapino, A., et al. Expression of CD31 by cells of extensive ductal in situ and invasive carcinomas of the breast. J. Path. 194 (2), 254-261 (2001).
  31. Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
  32. Cooley, B. C., et al. TGF-β signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Sci. Transl. Med. 6 (227), 227ra34-227ra34 (2014).
  33. Garcia, J., et al. Tie1 deficiency induces endothelial-mesenchymal transition. EMBO Rep. 13 (5), 431-439 (2012).
  34. Xiao, L., et al. Tumor endothelial cells with distinct patterns of TGFβ-driven endothelial-to-mesenchymal transition. Cancer Res. 75 (7), 1244-1254 (2015).
  35. Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
  36. Wang, L., et al. Identification of a clonally expanding haematopoietic compartment in bone marrow. EMBO J. 32 (2), 219-230 (2012).
  37. Sawamiphak, S., et al. Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis. Nature. 465 (7297), 487-491 (2010).
  38. Chi, J. -T., et al. Endothelial cell diversity revealed by global expression profiling. Proc. Natl. Acad. Sci. 100 (19), 10623-10628 (2003).
  39. Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev. Cell. 26 (2), 204-219 (2013).
  40. Ingram, D. A., et al. Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells. Blood. 105 (7), 2783-2786 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

תאי אנדותל של גידולהעשרה אימונו-מגנטיתשיטת בחירת מושבותהרחבת תאי אנדותלהפרדה באמצעות חרוזי מגנטטכניקת טבעת שיクלוניגסמן אנדותלי CD31מודל אנגיוגנזה של גידולטוהר תאי אנדותלתרבית במעבדה (In Vitro)
הרחבת בידוד והתרבות של תאי האנדותל גידול ספציפי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.