Методическая статья

3D Гидрогель Строительные леса для суставной хондроцит культуры и хряща поколения

21.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53085

⸱

7 октября 2015 г.

 ,  ,  , 
1Orthopaedic Surgery Department, Stanford University, 2Mechanical Engineering Department, Stanford University, 3Bioengineering Department, Stanford University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Восстановление хряща представляет собой нерешенную медицинскую проблему, и клеточные подходы к проектированию суставного хряща человека являются многообещающим решением. Здесь мы описываем трехмерные (3D) биомиметические гидрогели как идеальный инструмент для расширения и созревания суставных хондроцитов человека.

Аннотация

Суставной хрящ человека очень подвержен повреждениям и имеет ограниченный потенциал самовосстановления и регенерации. Клеточные стратегии для инженерии хрящевой ткани предлагают многообещающее решение для восстановления суставного хряща. Чтобы выбрать оптимальный источник клеток для восстановления тканей, важно разработать соответствующую культуральную платформу для систематического изучения биологических и биомеханических различий в тканеинженерном хряще различными клеточными источниками. В данной работе мы применили трехмерную (3D) биомиметическую платформу для культивирования гидрогеля для систематического изучения потенциала регенерации хряща ювенильных, взрослых и остеоартритных (ОА) хондроцитов. 3D биомиметический гидрогель состоит из синтетического компонента полиэтиленгликоля и биоактивного компонента хондроитина сульфата, что обеспечивает физиологически значимую микросреду для культивирования хондроцитов in vitro. Кроме того, каркас потенциально может быть использован для доставки клеток для восстановления хряща in vivo. Хрящевая ткань, сконструированная в каркасе, может быть оценена с помощью количественной экспрессии генов, иммунофлуоресцентного окрашивания, биохимических анализов и механических испытаний. Используя эти результаты, мы смогли охарактеризовать дифференциальный регенеративный потенциал хондроцитов различного возраста, как на уровне экспрессии генов, так и в биохимических и биомеханических свойствах сконструированной хрящевой ткани. 3D-модель культуры может быть применена для исследования молекулярных и функциональных различий между хондроцитами и клетками-предшественниками на разных стадиях нормального или аберрантного развития.

Введение

С его ограниченным потенциалом самовосстановления, человеческий суставной хрящ часто подвергается необратимым повреждениям. В настоящее время значительные усилия сосредоточены на разработке эффективных клеточных подходов к лечению повреждений суставного хряща. Успех этих методов клеточной терапии в значительной степени зависит от выбора оптимального источника клеток и поддержания их регенеративного потенциала. Хондроциты являются распространенным источником клеток для восстановления хряща, но их поступление ограничено и они могут дедифференцироваться во время расширения in vitro в культуре 2D-монослоя, тем самым ограничивая их генерацию гиалинового хряща 1.

Целью этого протокола является создание трехмерной гидрогелевой платформы для сравнительного исследования in vitro хондроцитов человека разного возраста и состояния заболевания. В отличие от обычной двумерной (2D) культуры, трехмерные (3D) гидрогели позволяют хондроцитам сохранять свою морфологию и фенотип и обеспечивают физиологически значимую среду, позволяющую хондроцитам производить хрящевую ткань 2,3. В дополнение к обеспечению трехмерной физической структуры для культивирования хондроцитов, гидрогели имитируют функцию нативного хрящевого внеклеточного матрикса (ВКМ). В частности, включение метакрилата хондроитина сульфата обеспечивает потенциальный резервуар для секретируемых паракринных факторов 4 и способствует клеточно-опосредованной деградации и обновлению матрикса5. Несмотря на то, что многие 3D-гидрогелевые системы культивирования широко использовались в различных исследованиях, включая агарозные и альгинатные гели, мы использовали биомиметическую 3D-систему культивирования, которая имеет некоторые явные преимущества для культивирования хондроцитов. Хондроитин сульфат (ХС) является распространенным компонентом в суставном хряще, и было показано, что гидрогели ПЭГ-ХС поддерживают и даже усиливают хондрогенный фенотип и способствуют клеточно-опосредованной деградации и обмену матрикса. Кроме того, механические свойства гидрогелевого каркаса могут быть легко модулированы путем изменения концентрации ПЭГ и, следовательно, могут быть использованы для дальнейшего повышения регенерационного потенциала хондроцитов или родственного типа клеток типа 6,7. PEG/CSMA также биосовместим и, следовательно, имеет потенциал для прямого клинического применения, например, при дефектах хряща. Ограничением для этой системы является ее сложность и использование фотополимеризации, которая потенциально может повлиять на жизнеспособность клеток по сравнению с более простыми системами, такими как агароза, однако преимущества для культуры хондроцитов перевешивают потенциальные ограничения.

Культура 3D гидрогеля совместима с обычным анализом для оценки фенотипа клеток (экспрессия генов, иммуноокрашивание белков) и функционального результата (количественная оценка производства хрящевого матрикса, механические испытания). Эта благоприятная 3D-среда была протестирована для сравнения потенциала регенерации тканей хондроцитов человека из трех популяций разного возраста в долгосрочных 3D-культурах.

Исходы оценивались с помощью как фенотипического, так и функционального анализов. Ювенильные, взрослые хондроциты и хондроциты ОА показали дифференциальную реакцию в 3D биомиметической гидрогелевой культуре. Через 3 и 6 недель экспрессия хондрогенных генов была повышена в ювенильных и взрослых хондроцитах, но была снижена в хондроцитах ОА. Отложение компонентов хрящевой ткани, включая аггрекан, коллаген II типа и гликозаминогликан (ГАГ), было высоким для ювенильных и взрослых хондроцитов, но не для хондроцитов ОА. Модули сжатия полученных хрящевых конструкций также демонстрировали аналогичные тенденции. В заключение следует отметить, что как ювенильные, так и взрослые хондроциты демонстрировали хондрогенную и хрящевую предрасположенность матрикса в течение 6 недель 3D-культуры в гидрогелях. Напротив, остеоартритные хондроциты показали потерю фенотипа хряща и минимальную способность генерировать крепкий хрящ.

Протокол

Все эксперименты были проведены в соответствии с руководящими принципами испытуемых Стэнфордский университет человека »и утвержден протокол Экспертный совет.

1. Суставной хондроцитов Изоляция

  1. Получить хрящ из ткани, выброшенных во время тотального эндопротезирования коленного сустава и анализировать, как описано ранее 8.
  2. Визуально выбрать медиальной или боковой бедренной мыщелков образцов хряща для гладких поверхностей и сделать разрез на поверхности хряща через скальпелем, чтобы удалить 4-5 мм хряща биопсии без воздействия субхондральной кости.
  3. Изолировать хондроциты из внеклеточного матрикса путем ферментативного разложения ткани с O / N лечении очищенной коллагеназы. Использование соотношении 1: 1 коллагеназы II (125 Ед / мл) и коллагеназы IV (160 Ед / мл) в среде роста хондроцитов при 37 ° С.
  4. На следующий день, фильтровать переваренной ткани, содержащей клетки диссоциированных через 70мм размер пор нейлоновая сетка. Промыть два раза с 20 мл DMEM / F12 и центрифуге при 600 х г в течение 5 мин.
  5. Пластина изолированных хондроциты при плотности 1 х 10 6 клеток / 60 мм чашки для культивирования следующие ресуспендирования в DMEM / F12, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 25 мкг / мл аскорбата, 2 мМ L-глутамина, противомикробных препаратов (100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 0,25 мкг / мл фунгизона). Хранить пластин при 37 ° С и поддерживают культуры хондроцитов первичные как высокой плотности монослоя до инкапсуляции в биомиметические гидрогелей.

2. Биомиметический Гидрогель Изготовление

Примечание: Этот метод позволяет синтез биомиметического гидрогеля, содержащего поли (этиленгликольдиакрилат) (PEGDA, МВт 5000 г / моль), хондроитин сульфат-метакрилат (CS-MA) в DPBS. Добавление фотоинициатора позволяет фотоактивированного сшивание. Окончательный состав гидрогеля содержит 7% вест / объем (вес / объем) PEGDA, 3% вес / объем CS-MA и 0,05% вес / объем фотоинициатора.

  1. Обобщить CS-MA по функционализации полимера CS с метакрилатными групп.
    1. Подготовка буферного раствора 50 мМ 2-morpholinoethanesulfonic кислоты (MES) и 0,5 М хлорида натрия (NaCl) путем растворения 1,952 г MES и 5,84 г NaCl в 200 мл деионизированной воды (DIH 2 O). Растворяют 5 г хондроитинсульфата натриевой соли в буферном растворе.
    2. Добавить 0,532 г (4,62 ммоль) N-гидроксисукцинимид (NHS) и 1.771 г (9,24 ммоль) 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDC) (мольное соотношение NHS: EDC = 1: 2) в раствор и перемешивают в течение 5 мин.
    3. Добавить 0,765 г (4,62 ммоль) 2-аминоэтил-метакрилат (AEMA) (мольное соотношение NHS: EDC: AEMA = 1: 2: 1) к раствору и поддержания реакции при КТ в течение 24 ч.
    4. Очищают смесь путем диализа против деионизированной воды (DIH 2 O) в течение 4 дней с использованием диализа (12-14 кДа MWCO).
    5. Фильтр рurified раствора через фильтр 0,22 мкм и помещают в открытые пробирки, содержащие раствор в эксикаторе и вакуумной O / N. Убедитесь, что все трубки защищены от света. Храните растворенного полимера при -20 ° С защищен от света и влаги.

3. Сотовый инкапсуляции

  1. Автоклав ПЦР кино и цилиндрические стержни (для пробивания клеточных нагруженные 3D гидрогели) и стерилизовать на заказ цилиндрическую форму геля погружением в 0,2 мкм фильтрованной 70% этанола в ткани капот культуры в УФ-свете.
  2. Уплотнение дна геля формы с автоклавного ПЦР пленки без воздушных пузырьков и зазоров для предотвращения утечек. Храните ее в стерильной 150 мм пластины.
  3. На следующий день перед клеток инкапсуляции в биомиметического гидрогеля, отделить высокой плотности монослоя хондроцитов с O / N в лечении коллагеназы II и решения Коллагеназа IV. Используйте 125 ед / мл коллагеназы для II и 160 U / мл коллагеназы для VI каждый роста хондроцитов СМИпри 37 ° С.
  4. Возьмем 50 мл трубки и добавить 5% вес / объем (в / о) поли (этиленгликольдиакрилат) (PEGDA, ММ = 5000 г / моль), 3% вес / объем хондроитинсульфат-метакрилат (CS-MA), и 0,05% вес / об фотоинициатора в DPBS. Vortex трубку для смешивания раствора и держать его в сторону. Защитите трубки от света.
  5. Сбор разложенных клеток в 50 мл Сокол трубки, рассчитывать и центрифуги при 460 мкг в течение 5 мин. Аспирируйте все средства массовой информации от клетки пробирку и добавляют выше смешанного геля, повторно приостанавливать клетки при плотности 15 × 10 6 клеток / мл. Смешайте его в 30 раз тщательно избегая пузырьков воздуха образование.
  6. Внесите 72 мкл клеточной суспензии гидрогеля-или только гидрогеля в заказ форму цилиндрической гель и вызывают гелеобразование в результате воздействия УФ-излучения (длина волны 365 нм) в 3 мВт / м 2 в течение 5 мин. Подготовить гидрогеля решение без содержимого ячейки. Используйте эти конструкции в качестве отрицательного контроля для будущего биохимических и механических испытаний. MeasuRe интенсивности ультрафиолетового света с измерителем интенсивности УФ. Для регулировки интенсивности, изменить расстояние между УФ источником света и гидрогеля эшафот во время гелеобразования.
    Примечание: Так как гидрогель содержит CS, бесклеточная вклад вычитается из биохимического состава ГАГ клеточных нагруженные гидрогели представляют только клеточный GAG.
  7. Используйте скальпель, чтобы сократить фильм для легкого пилинга от и тщательно удалите его. С помощью цилиндрических стержней, вытолкнуть гель в луночный планшет 6 5 мл стерильной ДЗФР смывать Неполимеризованные гель и свободные клетки.
  8. Культура клеток гидрогели нагруженные в 24-луночных планшетах, содержащих 1,5 мл роста хондроцитов сред в каждую лунку. Использование одноразовых шпатель для передачи промытых гидрогели в скважину.
  9. Оценка жизнеспособности клеток живой мертвой окрашивание 24 ч после инкапсуляции с использованием набора жизнеспособность / цитотоксичность. Культура клеточные Ладена гидрогели и пустые гидрогели для 3-6 недель изменение свежие хондроцитов GROт-й СМИ каждые 2 дня до сбора урожая для анализа.

4. Экстракция РНК и экспрессия генов анализ

  1. Тщательно аспирата СМИ и поставить стерильную PBS 1X на клетки-Ладена, а также пустые гидрогели управления.
  2. С помощью стерильным шпателем, передавать каждый гидрогель в чистую 1,5 мл пробирку Эппендорфа и добавить 250 мкл три-реагента в каждую пробирку. Следуйте инструкциям производителя, чтобы изолировать РНК.
  3. После изоляции РНК и количественного использования 1 мкг этом из каждого образца и выполнить обратную транскрипцию в кДНК в использовании High Capacity кДНК обратной транскрипцией Kit.
  4. Для количественной ПЦР TaqMan использовать экспрессии генов массивов для изучения экспрессии генов ваших интересов. Нормализация уровни экспрессии гена GAPDH внутренне.
  5. Для условий ПЦР включают 2 мин инкубации при 50 ° С инактивировать предыдущие ампликонов с гликозилаз урацил-ДНК, с последующим 10-60; мин инкубации при 95 ° C, чтобы активировать полимеразы Taq. Затем выполните сорок циклов ПЦР, состоящий из 15 сек при 95 ° С и 1 мин при 60 ° С.

5. Биохимические анализы

  1. Для каждой ячейки-гидрогель конструкций количественно ДНК и сульфатированных гликозаминогликанов (сГАГ) производство как следовать.
  2. Тщательно аспирата СМИ и поставить стерильную PBS 1X на клетки-Ладена, а также пустые гидрогели управления. Взвесить пустую трубку и положить, что гидрогель внутрь после блоттинга его на папиросную бумагу и записывать вес или влажный вес гидрогелей.
  3. Замораживание каждый гидрогель при -20 ° С в отдельном 1,5 мл пробирку Эппендорфа на ферментативного расщепления, а затем использовать Аликвоту расщепленной продукта для запуска PicoGreen определения (ДНК) и диметил-метиленовый синий определения (GAG).
  4. Подготовка papainase решение для ферментативного расщепления гидрогелей.
    1. Сначала подготовьте буфер PBE путем взвешивания 7,1 г натрия Phosphatе двухосновной (Na 2 HPO 4) и 1,6 г этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевой соли (ЭДТА-Na 2). Растворить в 500 мл дН 2 O, доведения рН до 6,5 и фильтруют через очищенного раствора 0,22 мм фильтр.
    2. Растворите 0,035 г L-цистеина в 20 мл буфера PBE. Фильтр решение и 100 мкл стерильной фермента папаина.
  5. Когда все будет готово для выполнения анализов, принять трубы от -20 ° С и добавить 300 мкл готового раствора папаина в замороженных гидрогелей. Измельчите гель с помощью ступки и пестика и хорошо перемешать с пестиком двигателя.
  6. Довести объем до 500 мкл с дополнительной решения папаин. Выполните ту же процедуру для гелей управления. Инкубируют при 60 ° С в течение 16 ч 3,9. Поэтому раствор, содержащий переваренной гидрогель может использоваться для ДНК и GAG количественного. Измерьте содержание ДНК с использованием анализа PicoGreen с ДНК фага лямбда в качестве стандарта следующее пр производителяotocol.
  7. Количественно содержание сульфатированных-GAG с помощью 1,9-диметилметилен синий (DMMB) анализа связывания красителя с акулой хондроитинсульфат в качестве стандартного 10. Определяют содержание GAG путем деления количества ГАГ для соответствующего сырого веса.

6. Механические испытания

  1. Выполните испытаний на неограниченное сжатие, используя Инстрон 5944 тестирования системы впрыска с датчиком нагрузки 10 Н.
    1. После нужные дни культуры в пробирке, выполнить тест на сжатие клеток-гидрогель эшафот и межклеточных гидрогели управления.
    2. Погрузите образцы в ванне PBS при комнатной температуре и сжатие в размере 1% деформации / с до максимальной деформации 15% 11,12 после физиологической деформации, испытываемой хрящевой ткани под условия нагрузки, как сообщается, будет на 10-20% 13,14.
  2. Создать стресс против деформационных кривых и кривой посадки с использованием полиномиального уравнения третьего порядка. Определить COMPRщий касательного модуля из кривой уравнения подборки при значениях деформации 15%.

Результаты

Биологически активные гидрогели, содержащие ПЭГ и CS фрагменты (рисунок 1) представляет собой идеальную платформу для культуры и созревания хондроцитов суставных 2,3,5,7 человека. Хондроцитов из разных возрастов и болезненных состояний можно культивировать с описанным способом и анализировали на их фенотип, экспрессии генов и биохимических и механических свойств хрящевой ткани, генерируемого. Три образца хондроцитов, ювенального 6 месяцев, взрослой жизни 34 лет и osteoarthritic- 74 лет, собирали через 3 недели культуры в 3D биомиметических гидрогелей. Экспрессия генов анализ нормальных хондроцитов, как несовершеннолетних и взрослых, показали увеличение экспрессии генов хондроцитов Col2a1 и Col6a1. Напротив, больные хондроциты показали резкое снижение Col2a1 сохраняя экспрессию Col6a1 (рисунок 2) показывает потерю хондрогенной фенотипа несмотря на то, культивируют в выгодном биомиметического среды.

Гидрогели CS-PEG также служить в качестве динамичной среде для хондроциты размножаться, переварить уже существующие матрицу ПЭГ и CS и хранение их перицеллюлярный и внеклеточный матрикс, основные компоненты зрелого хрящевой ткани. Учитывая эти способности, расширение хондроцитов после 3 недель культуры в пробирке можно оценить путем количественного ДНК с красителем PicoGreen. Сравнительный анализ трех групп клеток показывают, что плотность клеток несовершеннолетних и взрослых групп населения не изменилась, а О.А. хондроциты демонстрировали резкое снижение по сравнению с 1-й день культуры. Потеря содержания ДНК наблюдалось также для ОА, но не других хондроцитов, предлагая возможные гибель клеток во время долгосрочного культуры (рис 3). Секретируемый матрицы количественно как содержание сульфатированного GAG с красителем Анализ связывания DMMB на стадии конечной точки через 3 недели культуры. ГАГ содержание нормируется сырого веса гидрогеля как RecorДед до ферментативного расщепления и бесклеточной вклад вычитается. Как показано на рисунке 4, хондроциты хранение подобный значительное количество GAG в течение 3 недель культуры в 3D гидрогелей.

Наличие физической помост позволяет оценить биомеханических свойств образцов через испытаний на неограниченное сжатие 2,3. В то время как бесклеточные гидрогели пройти уменьшение сжатия модулей, сотовые Ладена конструкции поддерживается сжимающие модули после 3 недель в культуре (рисунок 4). Фенотипический, биохимические и биомеханические анализы, описанные здесь, следовательно, полезны для оценки и понимания потенциала разных групп населения хондроцитов для инженерной хряща.

figure-results-1
Рисунок 1. ПЭГ-CS биомиметических гидрогели для 3D хондроцитов кульры. Хондроциты ресуспендировали в смеси, содержащей поли (этиленгликольдиакрилат) (PEGDA) и хондроитин сульфат-метакрилата (CS-МА) и приведением в заказ цилиндрической форму для геля. После УФ-облучения, затвердевает гели собраны из форм и жизнеспособность клеток оценивают по живой мертвой окрашивания 24 ч после инкапсуляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2. Экспрессия генов в хондрогенных хондроцитов человека, культивируемых в 3D биомиметических гидрогелей. Количественный экспрессию генов хряща маркеров Col2a1 и Col6a1 несовершеннолетними, взрослых и ОА хондроциты через 3 недели культуры в 3D биомиметических гидрогелей. Значения нормированы на уровне экспрессии генов в день 1. Ошибка бARS представляют среднее ± SD. р * <0,05, как определено по тестам двух Стьюдента. Измененный Smeriglio др. 2 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3. Содержание ДНК в человеческих хондроцитов, культивируемых в 3D биомиметических гидрогелей. Количественное определение ДНК с помощью анализа PicoGreen в отношении несовершеннолетних, взрослых и ОА хондроциты через 3 недели культуры в 3D биомиметических гидрогелей. Значения нормированы на уровне ДНК в день 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-4 <ш /> Рисунок 4. Измерение содержания ГАГ и неограниченный испытание на сжатие человеческих хондроцитов в 1 день и через 3 недели культуры в 3D биомиметических гидрогелей. (А) ГАГ количественное по DMMB анализа в хондроцитах на 1 день и через 3 недели культуры в 3D биомиметические гидрогели. Значения нормированы на влажный вес (WW) и выражается в мкг / г. (Б) при сжатии модуль (кПа) бесклеточной и клеточных нагруженные гидрогели на 1 день и через 3 недели культуры в 3D биомиметических гидрогелей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенная версия этой фигуры.

Обсуждение

Как сообщалось, в этом протоколе, 3D гидрогели способны поддерживать фенотип хондроцитов в культуре, избегая процесса клеточной дифференцировке в клетки, как правило, волокнистый хрящ, с которыми сталкиваются с монослойных культур 15. Кроме того, долгосрочные культурах chondrocytes- гидрогеля конструкции показали благоприятную среду, которая поддерживает функции клеток внутренние, связанные с возрастом и болезнями.

Использование 3D биомиметического гидрогеля имеет несколько преимуществ. Во-первых, включение сульфата хондроитина (CS), основным компонентом найти в суставного хряща, позволяют клеткам деградировать гидрогеля матрицу, пряча хондроитиназу и лег вновь синтезированной хряща внеклеточного матрикса 5, 16. Кроме того, CS было показано чтобы иметь противовоспалительные свойства в артритом суставов. Биомиметический гидрогель можно также использовать в качестве материала для строительных лесов доставки клеток в восстановлении хрящей, а может быть химически модифицированычтобы облегчить ткани-биоматериал интеграции 17,18.

Использование гидрогелей ПЭГ-CS позволяет долгосрочные культур хондроцитов и оценку биохимических и механическими свойствами. Здесь мы показываем, как эта платформа может быть полезным для сравнительных анализов различных источников дифференцированных хондроцитов, чтобы определить оптимальный тип клеток для машиностроения хряща. Интересно, что хондроциты, заключенные в гидрогели остаются жизнеспособными и размножаются в соответствии с их собственными способностями. Опоры гидрогелевой композиции, по сути, рост здоровых хондроцитов молодых и взрослых, как показано на рисунке 2. Состав и структура описанных гидрогелей также способствует формированию хрящевой ткани, как указано осаждения функционального внеклеточного матрикса, оцененной гликозаминогликанов (GAG ) количественное.

Дополнительным преимуществом является то, что хондроцитов-гидрогелевые конструкцииможет быть оценена по механическим свойствам новообразованной хрящевой ткани. Следует отметить, что испытание на сжатие неограниченном должны быть выполнены на бесклеточной гидрогеля для сравнения. В гидрогели, на самом деле, имеют характеристическую жесткость за счет жесткости фрагментов CS. Неограниченном деформации сжатия, 5-20% (при скорости деформации 1% / с) могут быть применены для механических испытаний хрящевой ткани 11,12 после физиологической деформации, испытываемой хрящевой ткани под условия нагрузки, как сообщалось, 10-20 % 13,14. Реакция и клеток-Ладена и межклеточных гидрогелей в механических испытаний оценивалась в культуральной конечной точки. В описанном выше примере мы наблюдали сравнимую жесткость содержащих конструкций взрослых и подростков хондроциты, в отличие от нижней жесткости конструкций, содержащих ОА хондроциты. Такие механические свойства клеток-гидрогеля конструкции позволяют оценивать функциональных свойствахформируется ткань дает углубленный анализ способности клеток созревания.

В заключение, использование 3D-биомиметические гидрогелей изучить потенциал различных популяций хондроцитов для генерации хрящевой ткани может широко применяться. Кроме того, исследования в пробирке, описанных здесь, трансплантация в естественных клеточных нагруженные конструкции могут быть предусмотрены для изучения клеток и созревание регенеративный потенциал в физиологическом контексте. Дальнейшие модификации гидрогеля платформы с дополнительными биомиметических факторов также может быть предусмотрено, чтобы оптимизировать пролиферацию хондроцитов и созревание.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы выражают благодарность Стэнфордскому отделению ортопедической хирургии и гранту Стэнфорда Коултера за финансирование. J.H.L. хотел бы поблагодарить Национальный научный фонд Graduate Fellowship и DARE Doctoral Fellowship за поддержку.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ювенильные хондроциты (Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System )LonzaCC-2550
взрослые хондроциты (Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System)LonzaCC-2550
поли(этиленгликоль диакрилат)Laysan BioACRL-PEG-ACRL-1000-1g
2-морфолиноэтансульфоновая кислотаSigmaM5287
фотоинициаторIrgacure 2959
Натрия хлорид SigmaS9888
хондроитин сульфат натрия соль SigmaC9819
N-гидроксисукцинимидSigma130672
1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида гидрохлоридSigmaE1769
2-аминоэтилметакрилатSigma516155
диализная трубкаSpectrum Laboratories 132700
Коллагеназа 2Уортингтон биохимическая 
Коллагеназа 4Worthington Biochemical 
медиа DMEM/F12HyClone, Thermo Scientific SH3002301 
Анализ живых/мертвыхLife TechnologiesL3224
Tri реактивLife TechnologiesAM9738
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitInvitrogenP11496
Натрия фосфат двухбазовый SigmaS3264
Этилендиаминтетрауксусная кислота динатриевая соль SigmaE5134
L-цистеинSigmaC1276
1,9-диметилметиленовый синий Sigma341088
Instruments
Оборудование для ультрафиолетового излучения - XX-15LW Настольная лампа, 365 нмUVP95-0042-07
Испытательная система Instron 5944 Корпорация InstronE5940
LS004177LS004189

Ссылки

  1. Roberts, S., Menage, J., Sandell, L. J., Evans, E. H., Richardson, J. B. Immunohistochemical study of collagen types I and II and procollagen IIA in human cartilage repair tissue following autologous chondrocyte implantation. Knee. 16, 398-404 (2009).
  2. Smeriglio, P., et al. Comparative Potential of Juvenile and Adult Human Articular Chondrocytes for Cartilage Tissue Formation in Three-Dimensional Biomimetic Hydrogels. Tissue engineering. Part A. , (2014).
  3. Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels. Scientific reports. 3, 3553(2013).
  4. Taipale, J., Keski-Oja, J. Growth factors in the extracellular matrix. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11, 51-59 (1997).
  5. Varghese, S., et al. Chondroitin sulfate based niches for chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Matrix Biol. 27, 12-21 (2008).
  6. Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-beta. Biomaterials. 32, 3921-3930 (2011).
  7. Wang, T., Lai, J. H., Han, L. H., Tong, X., Yang, F. Chondrogenic Differentiation of Adipose-Derived Stromal Cells in Combinatorial Hydrogels Containing Cartilage Matrix Proteins with Decoupled Mechanical Stiffness. Tissue engineering. Part A. , (2014).
  8. Smith, R. L., et al. Effects of intermittent hydrostatic pressure and BMP-2 on osteoarthritic human chondrocyte metabolism in vitro. J Orthop Res. 29, 361-368 (2011).
  9. Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Kimura, J. H., Hunziker, E. B. Chondrocytes in agarose culture synthesize a mechanically functional extracellular matrix. J Orthop Res. 10, 745-758 (1992).
  10. Farndale, R. W., Buttle, D. J., Barrett, A. J. Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue. Biochim Biophys Acta. 883, 173-177 (1986).
  11. Lai, J. H., Levenston, M. E. Meniscus and cartilage exhibit distinct intra-tissue strain distributions under unconfined compression. Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society. 18, 1291-1299 (2010).
  12. Li, L. P., Buschmann, M. D., Shirazi-Adl, A. Strain-rate dependent stiffness of articular cartilage in unconfined compression. Journal of biomechanical engineering. 125, 161-168 (2003).
  13. Armstrong, C. G., Bahrani, A. S., Gardner, D. L. In vitro measurement of articular cartilage deformations in the intact human hip joint under load. The Journal of bone and joint surgery. American. 61, 744-755 (1979).
  14. Macirowski, T., Tepic, S., Mann, R. W. Cartilage stresses in the human hip joint. Journal of biomechanical engineering. 116, 10-18 (1994).
  15. Benya, P. D., Shaffer, J. D. Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels. Cell. 30, 215-224 (1982).
  16. Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. Articular cartilage: tissue design and chondrocyte-matrix interactions. Instructional course lectures. 47, 477-486 (1998).
  17. Wang, D. A., et al. Multifunctional chondroitin sulphate for cartilage tissue-biomaterial integration. Nat Mater. 6, 385-392 (2007).
  18. Simson, J. A., Strehin, I. A., Allen, B. W., Elisseeff, J. H. Bonding and fusion of meniscus fibrocartilage using a novel chondroitin sulfate bone marrow tissue adhesive. Tissue engineering. Part A. 19, 1843-1851 (2013).

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Метакрилат хондроитинсульфатадиакрилат полиэтиленгликоляферментативная диссоциацияУФ-фотополимеризациямеханические испытанияанализ экспрессии геновиммунофлуоресцентное окрашивание
3D Гидрогель Строительные леса для суставной хондроцит культуры и хряща поколения
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.