אספקת תאים ממוקדת שימושית במגוון יישומים ביו-רפואיים. מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש בננו-חלקיקי תחמוצת ברזל סופר-פרמגנטיים (SPION) כדי לתייג תאים ובכך לאפשר גישות מיקוד לתאים מגנטיים לרמה גבוהה של שליטה על העברת התאים ולוקליזציה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תיוג תא ומיקוד עם פאראמגנטי תחמוצת ברזל חלקיקים
במאמר זה
סיכום
תקציר
משלוח ממוקד של תאים וסוכנים טיפוליים ירוויח מגוון רחב של יישומים ביו-רפואיים על ידי ריכוז האפקט הטיפולי באתר היעד תוך מזעור השפעות מזיקות לאתרים מחוץ ליעד. מיקוד תא מגנטי הוא טכניקת אספקה יעילה, בטוחה, ופשוט. חלקיקי פאראמגנטי תחמוצת ברזל (SPION) מתכלים, ביולוגית, ויכולים להיות endocytosed לתאים להפוך אותם מגיב לשדות מגנטיים. התהליך כרוך ביצירת הסינתזה מגנטיט (Fe 3 O 4) ואחריו חלקיקי תחליב במהירות גבוהה כדי ליצור פולי (חומצה לקטית-שיתוף גליקולית) ציפוי (PLGA). SPIONs PLGA-מגנטיט הם כ -120 ננומטר בקוטר כולל ליבת מגנטיט הקוטר כ 10 ננומטר. כאשר הניח במדיום התרבות, SPIONs הם endocytosed באופן טבעי על ידי תאים ומאוחסן כצבירים קטנים בתוך endosomes cytoplasmic. חלקיקים אלה להקנות המוניים מגנטיים מספיק לתאיםכדי לאפשר מיקוד בשדות מגנטיים. מיון תא רב ויישומי מיקוד מופעלים על ידי עיבוד סוגי תאים שונים מגיבים לשדות מגנטיים. יש לי SPIONs מגוון רחב של יישומים ביו-רפואיים אחרים, כמו גם כוללים שימוש כחומר ניגוד הדמיה רפואית, מתן תרופות או גן ממוקד, מבחני אבחון, ודור של היפרתרמיה המקומית לטיפול גידול או הלחמת רקמות.
מבוא
אספקה ולכידה ממוקדת של תאים לאתרים ספציפיים בגוף רצויה למגוון יישומים ביו-רפואיים. העברת תאי גזע עצביים למוח על ידי אולטרסאונד ממוקד מונחה MRI הוצעה כאפשרות טיפול אפשרית למחלות ניווניות, פגיעה מוחית טראומטית ושבץ מוחי1. תאי גזע מזנכימליים נחקרים בשל יכולתם לספק תרופות אנטי-סרטניות לגידולים בשל תכונותיהם הטבעיות של הגידולהטרופי 2,3. תאי גזע לבביים הועברו ללב כטיפול אפשרי לאוטם שריר הלב4,5. סטנטים וסקולריים פותחו עם נוגדנים CD34 כדי ללכוד תאי אב במחזור6. בעוד שגישות מיקוד תאים אלה מבטיחות, מציגות חסרונות כולל חוסר ספציפיות תאים, שימור תאים לא עקבי ומסירת תאים מחוץ למטרה.
המטרה הכוללת של השיטה ה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. סינתזה של מגנטיט ג'ל
- לשטוף את כל כלי הזכוכית באמצעות חומצה הידרוכלורית מרוכזת ואחריו מים ללא יונים אחרי אתיל אלכוהול. לאפשר לו להתייבש O / N, רצוי בתנור ייבוש.
זהירות! החומצה הידרוכלורית מזיקה - ללבוש ציוד מגן אישי ועבודה במנדף; אתיל האלכוהול מזיק - ללבוש ציוד מגן אישי. - השתמש בבקבוק Dreschel לדה-גז 500 מיליליטר של H 2 O deionized בעדינות על ידי מבעבע גז 2 N במשך 30 דקות.
- הגדרת מנגנון סינתזת מגנטיט בתוך מנ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
חלקיקי מגנטיט הם כ 10 ננומטר בקוטר כתוצאה מערבוב תמיסה מימית של ברזל (III) tetrahydrate כלוריד וברזל כלוריד (II) על 50 מעלות צלזיוס ו1,000 סל"ד (איור 1). תוצאות אלו מראות סינתזה מוצלחת של ננו-חלקיקי מגנטיט. חשוב לוודא את הגודל והצורה של חלקיקי מגנטיט נלקחו ממדגם קטן של המנה כאשר מנסים סינתזה בפעם הראשונה. במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) הוא השיטה המועדפת להדמית חלקיקים אלה. אצווה צריך להיות מושלך והסינתזה צריכה להיות ניסיתי שוב אם חלקיקי מגנטיט אינם כ 10 נ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כמו עם כל פרוטוקול סינתזת ננו-חלקיקים, טוהר הכימיקלים מגיב הוא קריטי להשגת SPIONs באיכות גבוהה שיש השפעות רעילות לתאים מינימליות. לכן חשוב לרכוש חומרים כימיים טהורים מאוד, כולל חומצה אולאית (≥99%), ברזל tetrahydrate (II) כלוריד (≥99.99%), ברזל (III) כלוריד (≥99.99%), אתיל אצטט (כיתה HPLC, ≥99.9% ), הקסאן (כיתה HPLC, ≥97.0%), אמוניום הידרוקסיד (≥99.99%), ונתרן גופרתי (≥99.0%). זה הוא בעל חשיבות מיוחדת לרכישה מאוד טהור ואיכותי PLGA, אשר יכול להיות יקר יחסית. בנוסף, כל כלי הזכוכית יש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
המחברים מבקשים להכיר במימון מהקרן האירופית לפיתוח אזורי – FNUSA-ICRC (no. CZ.1.05/ 1.1.00/ 02.0123), מענק פיתוח מדענים של איגוד הלב האמריקאי (AHA #06-35185N), והמכונים הלאומיים לבריאות (NIH #T32HL007111).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תמיסת אמוניום הידרוקסיד, 28% NH3 ב-H2O, ≥ 99.99% בסיס קורט מתכת | סיגמא-אולדריץ' | 338818-100ML | מגיב מזיק - ללבוש ציוד מגן אישי |
| בקבוק Dreschel, 500 מ"ל | Ace Glass | 5516-16 | |
| אתיל אצטט, CHROMASOLVR Plus, עבור HPLC, 99.9% | Sigma-Aldrich | 650528-1L | מגיב מזיק - ללבוש ציוד מגן אישי ולעבוד בקולט אדים |
| אתילי | Sigma-Aldrich | E7023 | מגיב מזיק - ללבוש ציוד מגן אישי |
| בקבוק אידוי, 50 מ"ל, 24/40 Joint | Sigma-Aldrich | Z515558 | לשימוש עם מאייד רוטומאייד |
| נייר סינון, קוטר 3 ס"מ, דרגה 1 | פישר | 09-805P | לשימוש עם משפך מסנן זכוכית |
| כוסות זכוכית, 1 ליטר | פישר | FB-101-1000 | לשטיפת SPIONs |
| משפך מסנן זכוכית, מתאם צינור ואקום, מתאים 24/40, 30 מ"ל | פישר | K954100-0344 | |
| פקקי בקבוקון זכוכית | פישר | 03-391-46 | לשימוש עם בקבוקוני זכוכית |
| בקבוקוני זכוכית 2 מ"ל | פישר | 03-391-44 | לאיסוף ג'ל מגנטיט & SPIONs |
| Hexane, CHROMASOLVR, עבור HPLC, ≥ 97.0% (GC) | סיגמא-אולדריץ' | 34859-1L | מגיב מזיק - ללבוש ציוד מגן אישי ולעבוד במכסה אדים |
| חומצה הידרוכלורית | Sigma-Aldrich | H1758 | מגיב מזיק - ללבוש ציוד מגן אישי ולעבוד בקולט אדים |
| ברזל (II) כלוריד טטרהידרט, ≥ 99.99% בסיס מתכות קורט | Sigma-Aldrich | 380024-5G | מגיב מזיק - ללבוש ציוד מגן אישי |
| ברזל (III) כלוריד נטול מים, אבקה, ≥ 99.99% בסיס מתכות קורט | Sigma-Aldrich | 451649-1G | מגיב מזיק - ללבוש ציוד מגן אישי |
| מחמם איזומנטל, 500 מ"ל | Voight Global | EM0500/CEX1 | |
| מערבל מעבדה | Silverson | L5M-A | |
| Lyophilizer | Labconco | 7670520 | |
| Microspatulas | Fisher | 21-401-25A | להעברת מגנטיט מגנט ג'ל |
| NdFeB, 1 אינץ' x 1 אינץ' x 1 | במגנטים מדהימים | C1000H-M | מגנט חזק מאוד, טפל בזהירות |
| חומצה אולאית, ≥ 99% (GC) | סיגמא-אולדריץ' | O1008-5G | אחסן במקפיא; מגיב מזיק - ללבוש ציוד מגן אישי |
| בוחש עילי | IKA | 2572201 | |
| מהדק בוחש עילי | IKA | 2664000 | לשימוש עם בוחש עילי |
| בוחש תקורה H-stand | IKA | 1412000 | לשימוש עם בוחש עילי |
| פוספט חוצץ מלח | Life Technologies | 10010-023 | |
| כוסות פלסטיק, 250 מ"ל | ניתן להשתמש גם בפישר | 02-591-28 | |
| PLGA PURASORB PDLG (תערובת 75/25) | Purac | PDLG 7502 | PDLG 7502A; אחסן במקפיא |
| אבקת Pluronic F-127, BioReagent, מתאימה לתרבית תאים | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| משוט להב הניתן להרחבה PTFE, קוטר 8 מ"מ | SciQuip | SP4018 | |
| מתאם כלי PTFE, מתאים 24/40, משוט קוטר 8 מ"מ | Monmouth | Scientific PTFE מתאם כלי A480 | לשימוש עם משוט להב הניתן להרחבה PTFE |
| צ'ילר מחזורי | קלארקסון | 696613 | לשימוש עם מעבה ריפלוקס רוטו, |
| מתאים 24/40, 250 מ"מ | Ace Glass | 5997-133 | |
| מאייד רוטו | קלארקסון | 216949 | |
| מחיצת גומי, מתאים 24/40 | Ace Glass | 9096-56 | |
| משפך הפרדה עם פקק, 250 מ"ל | פישר | 10-438E | |
| נתרן גופרתי מגיב ACS, ≥ 99.0%, נטול מים, | סיגמא-אולדריץ' | גרגירי 239313-500G | |
| בקבוק תחתון עגול עם שלושה צווארים, זוויתי, 24/40 מפרקים, 500 מ"ל | Ace Glass | 6948-16 | |
| מחבת מחוררת מנקה אולטרסאונד | פישר | 15-335-20A | לשימוש עם שואב קולי |
| שואב קולי, 2.8 ליטר | פישר | 15-335-20 | |
| בקר ואקום | קלארקסון | 216639 | לשימוש עם מאייד רוטו (אופציונלי) |
| ואקום משאבת | קלארקסון | 219959 | לשימוש עם מאייד רוטו |
מקורות
- Burgess, A., et al. Targeted delivery of neural stem cells to the brain using MRI-guided focused ultrasound to disrupt the blood-brain barrier. PLoS One. 6 (11), e27877(2011).
- Nguyen, K. T.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
