Este protocolo describe un método de hibridación in situ rápido y simplificado ideal para el cerebro con prefijo de paraformaldehído, reduciendo así la necesidad de pasos complejos prolongados mientras se utilizan tejidos frescos congelados. El método se valida mediante la identificación del gen del receptor de serotonina 5-HT2A htr2a en ratas.
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Resumen
Resumen
3,4-La toxicidad de la metilendioximetanfetamina (MDMA; éxtasis) puede causar cambios específicos de la región en la expresión del ARNm serotoninérgico debido al síndrome agudo de serotonina (5-hidroxitriptamina; 5-HT). Esta hipótesis puede probarse utilizando hibridación in situ para detectar el gen del receptor de serotonina 5-HT2A htr2a. En el pasado, tales procedimientos, que utilizaban ribosondas radiactivas, eran difíciles debido al complicado flujo de trabajo que necesita varios días para realizarse y la dificultad adicional de que la técnica requería el uso de tejidos frescos congelados mantenidos en un entorno libre de ARNasa. Recientemente, el desarrollo de sondas cortas de oligonucleótidos ha simplificado los procedimientos de hibridación in situ y ha permitido el uso de secciones cerebrales prefijadas con paraformaldehído, que están más ampliamente disponibles en los laboratorios. Aquí, describimos un protocolo detallado utilizando sondas de oligonucleótidos no radiactivos en los tejidos cerebrales prefijados. Las sondas de hibridación utilizadas para este estudio incluyen dapB (un gen bacteriano que codifica para la dihidrodipicolinato reductasa), ppiB (un gen de mantenimiento que codifica para la peptidilprolil isomerasa B) y htr2a (un gen de serotonina que codifica para los receptores 5-HT2A). Este método es relativamente simple, barato, reproducible y requiere menos de dos días para completarse.
Introducción
El síndrome de serotonina (5-hidroxitriptamina; 5-HT) es un trastorno neurológico agudo causado por drogas promotoras de 5-HT, como los antidepresivos1, mientras que también ocurre en situaciones de uso de MDMA con fines recreativos2. Los mecanismos moleculares responsables de los cambios de humor, los déficits de aprendizaje y memoria que ocurren en asociación con el síndrome agudo no se conocen bien3,4. La hibridación in situ es una poderosa herramienta de investigación que permite la detección y cuantificación de ARNm específicos expresados potencialmente a nivel de una sola célula. La forma convencional de realizar la hib....
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Protocolo
Procedimientos de uso de animales se describen a continuación fueron aprobados por el Cuidado y Uso Comité Institucional Animal (IACUC) de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Ross y la Florida Atlantic University. Aunque se requieren técnicas y guantes estériles, el medio ambiente RNasa libre no es necesario durante el uso de este protocolo.
1. Preparación
- Preparación del tejido y seccionando
- Asignar ratas al azar en tres grupos: fresco / solución salina (SAL; 0,9% NaCl), el prefijo / SAL y el prefijo / 3,4-metilendioximetanfetamina (MDMA; véanse los detalles en el cuadro 1). ....
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Resultados
Utilizando las sondas de ARN oligonucleótido (<25 nt), la hibridación se puede detectar como puntos rojos en las células hipotalámicas preparados a partir de los cerebros congelados paraformaldehído prefijado y frescas. Las moléculas de ARNm HTR2A están presentes en algunas células (indicados por flechas continuas), pero no en otros (flechas abiertas). Hemos observado que no hay diferencia entre el paraformaldehído-prefijado y los tejidos congelados frescos (Figura 1). A la hibridación exito.......
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Discusión
Una de las principales preocupaciones de la prueba de hibridación in situ es elegir las técnicas apropiadas utilizadas para la preservación del ARN debido a las enzimas ARNasa. Es bien sabido que estas enzimas están ampliamente presentes en las células y el medio ambiente, lo que puede afectar los resultados. Sin embargo, la actividad enzimática se puede distinguir rápidamente colocando el tejido en la solución de hielo seco / alcohol5,12. Aunque la preservación rápida es fundamental para la hibridaci.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por el NIH subvención (R15DA029863), la concesión de la Universidad Florida Atlantic investigación de pregrado (M30014) y la Escuela de Medicina Veterinaria de la beca de investigación de la Universidad de Ross. Nos gustaría dar las gracias al Instituto Nacional sobre el Abuso de Drogas (Rockville, MD) para proporcionar (±) 3,4-metilendioximetanfetamina (MDMA ±) para este trabajo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sonda de control negativo de RNAscope-DapB | Diagnóstico celular avanzado, INC | 310098 | |
| RNAscope Pretreat 4 | Diagnóstico celular avanzado, INC | 320046 | |
| Kit de reactivos RNAscope 2.0 HD - Rojo | Diagnóstico de células avanzado, INC | 310036 | |
| Sonda de RNAscope - Rn-PPIB | Diagnóstico celular avanzado, INC | 313921 | |
| Rata Htr2a | Diagnóstico celular avanzado, INC | 300031 | |
| Criostato | Leica | CM 1850 | |
| Agitador horizontal | VWR | 88032-088 | |
| Horno de hibridación | Thermo Fisher Scientific | 222000 | |
| Portaobjetos de microscopio Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Bolígrafo hidrofóbico | Vector | H-4000 | |
| Microscopio | Olympus | Provis AX70 |
Referencias
- Muzyk, A. J., Jakel, R. J., Preud'homme, X. Serotonin syndrome after a massive overdose of controlled-release paroxetine. Psychosomatics. 51, 437-442 (2010).
- Davies, O., Batajoo-Shrestha, B., Sosa-Popoteur, J., Olibrice, M.
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Reimpresiones y permisos
